百子莲脱水素基因ApY2SK2逆境应答模式及启动子调控功能研究

陈晓童，吕 可，2，刘 涛，张 荻*

(1 上海交通大学 设计学院 风景园林系，上海 200240；2 杭州千岛湖全域旅游有限公司，杭州 311700)

干旱、极端温度和盐碱等逆境胁迫会导致植物组织或器官的机械损伤，细胞失水，膜脂过氧化等胁迫伤害，甚至导致植物的死亡[1]。脱水素是植物抵御逆境胁迫的一类重要保护蛋白，它具有稳定细胞膜、清除自由基和保护细胞免受脱水伤害等功能[2]。一些植物遭受干旱、低温和渗透等逆境胁迫，脱水素类保护蛋白会大量表达积累。研究表明植物的抗逆能力与脱水素基因在逆境胁迫下的表达相关，通常在抗逆植株中的脱水素表达量高于敏感型植株[3-4]。启动子是基因转录调控的控制中心，可响应多种上游调控信号[5-6]。不同植物的脱水素的蛋白功能与响应模式差别巨大[7-8]。因此，挖掘具有抗逆保护功能的脱水素基因及揭示其基因应答机制对于植物逆境胁迫具有重要研究意义。

脱水素等基因的启动子通常含有较多的与组织定位、逆境和激素响应相关的顺式调控元件，能够有效控制基因的组织表达，逆境及激素信号响应。已有研究报道表明，陆地棉(Gossypiumhirsutum)LEA基因D34启动子可以驱动GUS基因在拟南芥种子中的特异性表达，具有严格的种子表达专一性[9]。水稻OsPM1启动子和番茄(Solanumlycopersicum)脱水素基因SlDHN2b的启动子序列含多个与逆境相关的顺式调控元件，可以响应干旱、高盐、ABA等逆境和激素信号[10-11]。厚藤(Ipomoeapes-caprae)脱水素基因的启动子可驱动基因在异源植物中稳定表达，且在盐、渗透胁迫和ABA激素处理下基因呈上调表达趋势[12]。启动子上顺式调控元件间可协同发挥作用，ABRE元件可以同CE3、DRE、CRT及其他顺式调控元件共同参与干旱胁迫下的ABA应答反应[13]。研究基因的启动子在一定程度上可以揭示基因的功能，并为基因的表达调控机制研究提供基础。

超低温保存可以用来保存植物胚性细胞等珍贵离体种质资源，超低温保存为防止胞内冰晶形成，利用植物玻璃化液(PVS)进行预处理，但在超低温保存的预处理过程中，存在低温胁迫、高渗胁迫、脱水胁迫等复合逆境胁迫，这些胁迫会对植物胚性细胞造成离子毒害、氧化胁迫伤害等。前期本团队在百子莲胚性愈伤组织超低温处理过程中筛选出能积极响应复合逆境胁迫的脱水素蛋白ApY2SK2[14-15]，并开展了一系列蛋白保护功能的相关研究，发现ApY2SK2脱水素蛋白中含有2个Y片段，1个S片段和2个K片段，属于YnSKn型脱水素，并在渗透、脱水和低温胁迫下对植物细胞具有重要的保护功能[16]。为进一步了解ApY2SK2脱水素基因的转录调控模式，利用染色体步移法克隆出ApY2SK2脱水素基因上游约1 200 bp的启动子序列，进行顺式调控元件预测分析，利用基因表达定量分析百子莲脱水素基因ApY2SK2表达模式，分别利用瞬时转化烟草和稳定转化拟南芥探究不同胁迫和激素处理下ApY2SK2启动子不同缺失片段的活性，明确了该启动子的类型和核心功能区域，以揭示在不同逆境下脱水素基因ApY2SK2的应答调控模式，为园林植物抗逆遗传改良提供一种基因调控工具。

1 材料和方法

1.1 植物材料与实验试剂

百子莲(Agapanthuspraecox)‘蓝色大花’(Big Blue)、野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana)为Col-0、本氏烟草(Nicotianabenthamiana)、pBI121质粒均由本实验室长期保存；染色体步移试剂盒、植物基因组DNA提取试剂盒、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、TB Green Premix EX TaqTM Ⅱ、限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶购于大连宝生物工程有限公司。大肠杆菌感受态DH5α和农杆菌感受态GV3101购自上海唯第生物有限公司。SanPrep柱式DNA 胶回收试剂盒和常规生化药品与引物合成由上海生工生物有限公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 百子莲ApY2SK2启动子序列克隆及顺式调控元件分析利用染色体步移法，以百子莲基因组DNA为模板，经过两次3轮连续的热不对称巢式PCR，克隆ApY2SK2脱水素基因5′-端上游启动子序列。下游特异性引物(ApY2SK2-SP1-1/2/3，ApY2SK2-SP2-1/2/3)见表1，上游引物AP Primer和具体的PCR程序均参考 TaKaRa 染色体步移试剂盒。第一次染色体步移以ApY2SK2-SP1-1/2/3特异性引物和AP1随机引物进行3轮热不对称PCR。根据第一轮染色体步移获得的基因序列设计ApY2SK2-SP2-1/2/3作为特异性引物进行第二次染色体步移，进行3轮PCR。Clustalx(1.81)软件拼接和修正两次克隆的测序结果，最终得到ApY2SK2基因上游的启动子序列。利用Promoter 2.0 Prediction Server和plantCARE启动子分析软件，预测其转录起始位点与顺式调控元件。

1.2.2 百子莲ApY2SK2脱水素基因表达模式分析取百子莲植株的根、叶、花和果不同组织的样品进行RNA提取、cDNA反转录和实时荧光定量PCR测定不同组织中ApY2SK2基因的表达量。基于课题组前期对脱水素ApY2SK2转基因拟南芥研究[16]及百子莲抗逆性相关研究文献[17-18]，选取干旱(20% PEG)、渗透(400 mmol/L甘露醇)、盐(3% NaCl)、低温(4 ℃)、高温(45 ℃)对百子莲幼苗进行胁迫处理。在0、1、3、6、12和24 h对根尖和叶尖进行取样；对百子莲幼苗进行ABA激素(100 mol/L)喷施处理，于0、0.5、1、2、4 和8 h进行根尖和叶尖取样。提取样品总RNA、反转录成cDNA，应用实时荧光定量PCR技术测定不同胁迫和激素处理下百子莲根和叶中ApY2SK2基因的表达量。以Ap-Actin为内参基因，引物见表1，数据处理采用2-ΔΔCt法。

1.2.3ApY2SK2启动子缺失片段克隆及植物表达载体构建根据ApY2SK2启动子顺式调控元件分析结果，进行ApY2SK2启动子5′-缺失片段克隆，5条正向引物和1条反向引物见表1。将5个ApY2SK2启动子5′-缺失片段和pBI121载体经HindⅢ和XbaⅠ双酶切后相连，分别用5个ApY2SK2启动子5′-缺失片段替换pBI121载体的CaMV35S启动子，形成融合表达载体。转化大肠杆菌，选取阳性菌进行测序，利用冻融法将5个ApY2SK2融合表达载体转入农杆菌，检测并保存。

表1 实验中使用的引物

1.2.4ApY2SK2启动子缺失片段瞬时转化烟草叶片人工气候箱(温度26 ℃，光周期16 h光照/8 h黑暗)培养至4～6周的本氏烟草用于瞬时表达分析，方法参照Wang等[19]的方法。以含pBI121空载的GV3101农杆菌株为阳性对照，GV3101菌株为阴性对照。培养农杆菌菌液至OD600为0.5左右，离心10 min收集菌体，MS液体培养基重悬菌体至OD为0.6，加入AS(终浓度0.2 mmol/L)和MES溶液(终浓度10 mmol/L)混匀，于28 ℃黑暗中静置3 h用于侵染。含各ApY2SK2启动子5′-缺失片段融合表达载体菌液以及阳性对照和阴性对照菌液分别注射烟草叶片，侵染后的烟草暗培养24 h后用于后续不同逆境、激素诱导实验。用注射器向叶片注入4% PEG溶液、200 mmol/L NaCl溶液和50 mol/L ABA溶液后暗培养24 h。对整株烟草进行4 ℃低温处理4 h后暗培养4 h。应用打孔器取样进行GUS蛋白组织染色分析，方法参照Jefferson[20]的方法。取植物材料，于GUS染色液中37 ℃保温24 h后，用70%的酒精进行脱色处理，体视显微镜下镜检观察并拍照保存。

1.2.5 拟南芥遗传转化与阳性植株的筛选鉴定利用花序侵染法将上述构建完成的植物融合表达载体遗传转化拟南芥。将获得的转基因T1代种子在含50 mg/L卡那霉素(Kana)的MS固体培养基上筛选阳性转化植株。以表1中载体通用引物和Kana基因特异性引物进行PCR鉴定阳性转基因植株。直至获得T3代种子，用于后续实验检测。

1.2.6 转基因拟南芥GUS组织化学染色取ApY2SK2启动子转基因拟南芥5、7、10和14 d的幼苗和成熟叶片、花以及不同发育阶段的角果进行GUS组织化学染色，37 ℃保温24 h后，用70%的酒精进行脱色，体视显微镜观察并拍照保存。

1.2.7 不同逆境与外源激素诱导下转基因拟南芥GUS活性测定经消毒后的T3代转基因拟南芥种子播种于MS固体培养基上，放置于光照培养箱中培养14 d后分别移入20% PEG、400 mmol/L D-Mannitol、200 mmol/L NaCl的MS固体培养基进行干旱、渗透和盐胁迫处理，移入4 ℃低温培养箱进行低温胁迫处理；喷施100 mol/L ABA进行外源激素处理。以转入pBI121空载的拟南芥为阳性对照，以不做任何外源处理的植株为空白对照。参照Wang等[19]的方法，对不同逆境与外源激素处理下转基因拟南芥GUS活性进行定量检测。GUS活性测定参照Jefferson[20]的方法，取各处理组转基因拟南芥植株，液氮研磨后进行蛋白的提取，考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，使用酶标法测定GUS催化生成的产物4-MU的荧光强度，根据4-MU浓度标曲计算出各样品的GUS活性。

1.3 数据统计分析

采用SAS 9.1.3对数据进行统计分析，LSD(least significant difference test，最小显著差异检验)进行差异显著性分析，Origin 9.1软件作图。

2 结果与分析

2.1 百子莲ApY2SK2启动子序列及顺式调控元件分析

以百子莲基因组DNA为模板，经过两次3轮连续的热不对称巢式PCR，克隆出ApY2SK2脱水素基因5′-端上游启动子序列。第一次染色体步移经3轮热不对称PCR后，以ApY2SK2-SP1-1和AP1为引物的第3泳道(图1，A)获得5′-端上游710 bp的基因序列。第二次染色体步移，以ApY2SK2-SP2-1/2/3作为特异性引物(表1)，经3轮PCR后获得932 bp启动子序列(图1，B)。Clustalx(1.81)软件拼接和修正2次克隆的测序结果，最终得到ApY2SK2基因上游1 200 bp的启动子序列。

M. DL2000；A. 第一次染色体步移：1. ApY2SK2-SP1-1；2. ApY2SK2-SP1-2；3. ApY2SK2-SP1-3; B. 第二次染色体步移：1.ApY2SK2-SP2-1；2. ApY2SK2-SP2-2；3. ApY2SK2-SP2-3图1 百子莲脱水素基因ApY2SK2启动子染色体步移凝胶电泳M. DL2000; A. Primary chromosome walking：1. ApY2SK2-SP1-1; 2. ApY2SK2-SP1-2; 3. ApY2SK2-SP1-3; B. Secondary chromosome walking：1. ApY2SK2-SP2-1; 2. ApY2SK2-SP2-2; 3. ApY2SK2-SP2-3Fig.1 Agarose gel electrophoresis of chromosome walking for ApY2SK2 promoter

将百子莲ApY2SK2启动子序列提交PlantCARE在线分析，预测结果(图2，表2)表明，ApY2SK2启动子含有多个结构元件如TATA BOX和CAAT BOX，3种激素响应元件CE3/ABRE(脱落酸应答元件)、GARE-motif(赤霉素应答元件)，6种胁迫响应元件LTR(低温应答元件)、MBS(MYB结合位点干旱应答元件)、HSE(热激应答元件)、GC-motif(厌氧诱导增强子)、ARE(厌氧应答元件)和TC-rich repeats(防御与应激应答元件)，5种光响应元件G-box、GATA-motif、GT1-motif、I-box和ACE，两种生长发育调控元件Skn-1 motif和RY-element。

起始密码子 “ATG”的“A”被指定为“+ 1”。顺式作用元件使用方框，下划线标记，红色标注的为与逆境胁迫及激素调控相关的元件，水平箭头表示方向。序列上方的垂直箭头表示不同缺失片段的起始点; 蓝色核苷酸序列代表用于扩增缺失片段的特殊正向引物图2 ApY2SK2启动子DNA序列The “A” of the translation initiation code “ATG” of ApY2SK2 was designated as “+ 1”. Putative cis-acting elements are boxed and underlined. Cis-elements related with stress and hormone are marked in red. The horizontal arrows show their directions.The vertical arrow above the sequence indicates the start point of different deletion fragments; the blue nucleotide sequences represent special primers for amplifying deletion fragmentsFig.2 DNA sequences of ApY2SK2 promoter

表2 ApY2SK2启动子区域顺式调控元件预测

2.2 百子莲脱水素基因ApY2SK2在不同组织和逆境下表达模式分析

利用实时荧光定量PCR分析脱水素基因ApY2SK2在百子莲根、叶、花等不同组织中的表达情况。结果(图3)表明，ApY2SK2的表达具有组织特异性，其中在叶和果中表达量较高，且差异显著，在根和花中微量表达。

不同小写字母代表同一处理下于不同组织间差异著性(P<0.05)图3 百子莲ApY2SK2基因在不同组织中的表达Different normal letters represent significant differences among different tissues(P<0.05)Fig.3 Expression patterns of ApY2SK2 gene in different tissues of A. praecox

百子莲脱水素基因ApY2SK2启动子序列含有多种与逆境胁迫和激素相关的顺式调控元件，为了进一步探究逆境胁迫、激素与脱水素基因ApY2SK2的表达模式之间的调控关系，对百子莲幼苗进行干旱、渗透、盐、低温和高温逆境处理，喷施 ABA进行激素处理，分析ApY2SK2基因在不同胁迫、激素处理下的表达模式。结果(图4)表明，在百子莲幼苗空白对照(0 h)处理下，ApY2SK2基因在根和叶中的转录表达水平较低，说明正常生长的百子莲幼苗中ApY2SK2基因的转录水平较低；而在逆境和激素处理下，百子莲幼苗中的ApY2SK2基因转录水平显著上调，其中根中ApY2SK2基因对干旱、渗透和盐处理具有积极的响应，而叶片中ApY2SK2对高温、低温和ABA处理响应较强。在PEG(干旱)胁迫处理下，ApY2SK2基因于12 h在根中表达量达到峰值，与0 h相比，上调18.34倍(图4，A)；在渗透处理下，ApY2SK2基因在根和叶中的表达均呈现单峰模式，在12 h达到峰值，与0 h相比，在根中的表达上调266.10倍，在叶中的表达上调75.58倍(图4，B)；在NaCl(盐)处理下，与0 h相比，6 h时ApY2SK2基因在根中的表达达到峰值，上调116.74倍，而在叶中的表达变化小(图4，C)；在低温处理下，与0 h相比，3 h时ApY2SK2基因在叶中的表达达到峰值，上调187.18倍，而在根中的上调表达幅度小(图4，D)；在高温处理下，与0 h相比，ApY2SK2基因在叶和根中的表达变化均小，于1 h时在叶中ApY2SK2基因的表达达到峰值，上调2.55倍(图4，E)；在ABA处理下，ApY2SK2基因主要在叶中上调表达，于处理2 h时达到峰值，上调126.24倍(图4，F)。综上，百子莲ApY2SK2基因的表达显著受非生物逆境，如干旱、盐、渗透、低温和高温，以及ABA激素信号的诱导。百子莲ApY2SK2基因对渗透和低温胁迫信号响应最强，其次是盐和ABA，对高温信号响应较弱。

不同小写字母代表同一组织不同处理时间差异显著(P<0.05)图4 百子莲叶和根在逆境胁迫和激素处理下ApY2SK2基因的相对表达量Different normal letters represent significant differences among different time points with the same tissue(P<0.05)Fig.4 Expression patterns of ApY2SK2 gene in leaves and roots of Agapanthus praecox under virous abiotic stress and hormone treatments

2.3 ApY2SK2启动子缺失片段克隆及植物表达载体构建与鉴定

为明确ApY2SK2启动子的核心功能区域，根据启动子顺式调控元件分析结果对获得的启动子片段进行5′-端缺失克隆，并且成功构建了5个植物融合表达载体(图5)。将植物融合表达载体转化农杆菌，并用含有上述植物融合表达载体的农杆菌侵染液成功侵染拟南芥，经抗性筛选和PCR检测鉴定，获得T3代纯和转基因拟南芥株系用于后续实验。

Ⅰ. ApY2SK2启动子∷GUS载体构建体的示意图；nos pro，胭脂碱合成酶启动子；nos terminator，胭脂碱合成酶终止子；GUS，β-葡萄糖苷酶基因；RB 和 LB，左右T-DNA 边界；ApY2SK2启动子在载体中的插入位置用限制性内切酶位点表示(Hind Ⅲ和Xba Ⅰ)。 Ⅱ. 用于测定转基因拟南芥和本氏烟草叶中 GUS 活性的不同 5′-缺失ApY2SK2启动子构建体的示意图。标尺为ATG起始位点上游碱基数目，不同形状和颜色的图形代表主要的顺式作用元件图5 ApY2SK2启动子及其缺失片段表达载体载体构建示意图Ⅰ. Schematic representation of ApY2SK2 promoter∷GUS vector constructs; nos pro, nopaline synthase promoter; nos ter, nopaline synthase terminator; GUS, β-glucosidase gene; RB and LB, left and right T-DNA borders; The insertion position of the ApY2SK2 promoter in the vector is indicated with restriction enzyme sites (Hind Ⅲ and Xba Ⅰ). Ⅱ. Schematic representation of the different 5′-deletion ApY2SK2 promoter constructs used to assay GUS activity in transgenic Arabidopsis thaliana and tobacco leaves. These constructs are based on the pBI121 vector. The main cis-elements are represented with different patternsFig.5 Schematic representation of construction of different deletion constructions of ApY2SK2 promoter

2.4 转基因拟南芥GUS组织化学染色分析

为揭示ApY2SK2基因的启动子活性及其在植物发育过程中的组织表达模式，分别对转基因拟南芥不同生长时间(5、7、10和14 d)的植株、成熟叶片、花、不同发育阶段的角果进行GUS组织化学染色，结果如图6所示，ApY2SK2基因的启动子能够驱动GUS基因的正常表达，具有启动子活性。ApY2SK2基因的启动子驱动的GUS基因在拟南芥幼苗的根和叶中均具有较高的表达活性，在成熟叶片和花中可稳定表达，在成熟果实中也具有一定表达活性，但在未成熟果实中无明显表达。

a. 5 d幼苗；b. 7 d幼苗；c. 10 d幼苗；d. 14 d苗；e. 成熟叶；f. 花；g. 未成熟角果；h. 成熟角果图6 转基因拟南芥GUS染色a. 5-day-old seedling; b. 7-day-old seedling; c.10-day-old seedling; d. 14-day-old seedling; e. Mature leaf; f. Flowers; g. Immature siliques; h. Mature siliquesFig.6 GUS histochemical staining of transgenic Arabidopsis thaliana

2.5 转基因烟草在胁迫和激素处理下的GUS瞬时表达

为验证ApY2SK2启动子各缺失片段活性及在不同胁迫和激素处理下的响应模式，对不同胁迫和激素处理的转基因烟草叶片进行GUS组织化学染色，结果如图7，阳性对照可检测到GUS基因的表达，叶片呈现深蓝色；而阴性对照均无GUS基因的表达，叶片未能染色。在空白处理下(CK)，5个5′-启动子缺失片段均可驱动GUS基因表达，说明各缺失片段均具有启动子活性；而在非生物胁迫处理下，不同5′-启动子缺失片段驱动的GUS基因表达有明显差异性。ABA激素处理下，与空白对照相比各5′-启动子缺失片段驱动GUS基因表达均明显增强，说明各缺失片段均可响应ABA激素。干旱处理下，与空白对照相比pApY2SK2-1199、pApY2SK2-946、pApY2SK2-670驱动的GUS基因表达明显增强，说明-1 199～-262 bp可响应干旱胁迫。而在盐和低温胁迫处理下，仅pApY2SK2-1199驱动的GUS基因表达有显著差异，说明-1 199～-946 bp可响应盐和低温胁迫。

图7 ApY2SK2启动子及其缺失片段在不同胁迫激素处理下烟草叶片中瞬时表达Fig.7 Transient expression of different ApY2SK2 promoter deletions in tobacco under various abiotic stress or hormone treatments

2.6 转基因拟南芥在胁迫和激素处理下的GUS表达分析

正常环境(CK)下转基因拟南芥GUS活性如图8，pApY2SK2-1199、pApY2SK2-946、pApY2SK2-670启动子片段驱动的GUS活性(110.4、84.2、47.0 nmol·min-1·mg-1)与pApY2SK2-262、pApY2SK2-167(2.2、1.5 nmol·min-1·mg-1)存在显著性差异，表明-1 199～-262 bp为ApY2SK2启动子的重要活性区段。

大写字母代表不同启动子缺失片段在相同胁迫的显著差异(P<0.05)；小写字母代表相同启动子缺失片段在不同胁迫下的显著差异(P<0.05)图8 ApY2SK2启动子及其缺失片段在不同胁迫激素处理下的GUS活性Capital letters represent the significance of difference between the different ApY2SK2 promoters in the same treated condition (P<0.05); normal letters represent the significance among the same ApY2SK2 promoter under different treatments (P<0.05)Fig.8 GUS activity of transgenic Arabidopsis seedlings containing ApY2SK2 promoter and its deletion constructs under virous abiotic stress and hormone treatments

不同胁迫和激素处理下的转基因拟南芥GUS基因表达如图8，PEG处理下，pApY2SK2-1199和pApY2SK2-946的GUS活性与对照相比有显著差异，分别为对照的6.87、1.80倍，证明ApY2SK2启动子-1 199～-670 bp可以响应干旱胁迫，而位于-1 047～-1 041 bp的 MBS干旱胁迫响应元件可参与干旱胁迫应答。Mannitol处理下，与干旱结果一致，pApY2SK2-1199和pApY2SK2-946的GUS酶活与对照相比有显著性差异，分别为对照的3.46、2.67倍，表明ApY2SK2启动子-1 199～-670 bp同样为渗透胁迫的主要响应区域，根据顺式调控元件分析结果，-812～-807 bp处的ABRE元件可能参与渗透胁迫应答。NaCl处理下，pApY2SK2-1199、pApY2SK2-946、pApY2SK2-670、pApY2SK2-167的GUS活性与对照相比有显著差异，为对照的1.50～8.64倍，证明ApY2SK2启动子-1 199～-262 bp、-167～0 bp可以响应盐胁迫。Cold处理下，pApY2SK2-1199与对照相比有显著差异，为对照的8.44倍，证明ApY2SK2启动子-1 199～-946 bp存在顺式调控元件可以响应低温胁迫，与启动子顺式调控元件预测结果一致，-1 040～-1 034 bp的 LTR为低温胁迫响应顺式调控元件。ABA激素处理下，与对照相比，pApY2SK2-1199、pApY2SK2-946、pApY2SK2-670的GUS活性上调3.25、4.70、3.24倍，证明ApY2SK2启动子-1 199～-262 bp为ABA激素的响应区域，而-373～-211 bp处存在多个ABRE顺式调控元件可响应ABA激素。

3 讨 论

脱水素是一种在多种植物中广泛分布的逆境保护蛋白[21]。研究发现部分植物脱水素蛋白的组织定位具有时空特异性，即脱水素基因表达受发育阶段和组织器官的影响。基因的表达受启动子的调控，启动子的顺式调控元件能够决定该基因的表达受哪些转录因子的控制。为探究ApY2SK2基因的时空表达模式，通过实时荧光定量PCR测定ApY2SK2基因在百子莲不同组织中表达情况，研究结果显示ApY2SK2基因在百子莲的各组织中均可正常表达，在叶和果中表达量较高；为进一步揭示ApY2SK2启动子的活性和组织特异性。对ApY2SK2启动子转基因拟南芥进行GUS组织化学染色，结果显示ApY2SK2启动子驱动下的GUS基因在拟南芥的各发育阶段均可稳定表达，但在拟南芥未成熟角果中无明显表达而在成熟角果中表达。同时ApY2SK2启动子序列信息分析结果显示，在启动子区域具有与种胚发育相关的生长发育调控元件Skn-1 motif、RY-element存在，这正好与上述GUS基因在拟南芥未成熟角果和成熟角果中表达差异特性相吻合，推测ApY2SK2启动子可调控种胚的发育。有文献报道，棉花的LEA基因D34的启动子含种子发育相关顺式调控元件，贮藏蛋白基因特异表达调控元件2SSEEDPROTBANAPA (CAAACAC)和胚乳表达必需的调控元件Skn-1motif (GTCAT)等，并且可以驱动GUS基因在种子发育后期特异表达，与ApY2SK2启动子类似，具有组织特异性和发育阶段性调控功能[9]。而拟南芥角果在发育成熟阶段，需经历脱水这一过程，亦可推测ApY2SK2启动子可以响应种胚成熟脱水过程中的胁迫信号从而调控脱水素的表达进而保护细胞免受脱水伤害。

逆境信号与脱水素的转录调控间存在密切关系。已有研究证实，当植物遭受干旱、低温、盐碱和渗透等胁迫时，脱水素会大量表达积累以增强植物的抗逆性。应用实时荧光定量PCR测定ApY2SK2基因在不同胁迫和激素处理下的ApY2SK2表达水平，结果显示其表达量在渗透、低温、盐胁迫、干旱和ABA激素处理下显著上调。而ApY2SK2启动子序列含有2种ABA激素响应元件CE3、ABRE和6种胁迫响应元件LTR、MBS、HSE、GC-motif、ARE和TC-rich repeats，表明该启动子可能受ABA激素及多种逆境信号的诱导进而调控基因的表达。为进一步证明了ApY2SK2启动子具有响应不同逆境和激素信号的调控功能，基于其顺式调控元件分布情况，对ApY2SK2启动子进行5′-缺失实验验证。烟草叶片瞬时表达分析结果显示，各ApY2SK2启动子缺失片段均具有转录调控活性，且在不同胁迫和激素处理下各缺失片段活性存在较大差异，其中各缺失片段对干旱和ABA激素信号具有较强的响应。对不同胁迫和激素处理下的ApY2SK2启动子各缺失片段转基因拟南芥幼苗进行了GUS活性测定，结果表明ApY2SK2启动子的多个ABRE元件响应ABA、干旱与高渗信号； MBS元件响应干旱胁迫； LTR元件可响应低温胁迫。ApY2SK2启动子-1 199～-262 bp存在8个ABRE元件，并参与多种胁迫和激素信号的应答，这与文献所报道的ABRE元件可以参与干旱、盐、低温和ABA等多种逆境和激素应答一致[22-24]。据文献报道称，脱水素基因的表达可以分为依赖ABA和不依赖ABA途径两种，ABA依赖型脱水素基因上游响应ABA调控的一类顺式元件是ABREs[4, 25-26]。ApY2SK2启动子-373～-211 bp区段存在多个串联ABRE元件，且GUS活性随ABREs拷贝数减少而降低，说明ABREs的拷贝数与启动子对ABA激素的响应程度间存在正相关关系，这与已有文献报道的ABRE元件单拷贝不足以赋予ABA诱导型启动子转录诱导活性的结果一致[27-29]。本研究中发现-233～-126 bp的2个ABRE和1个CE3元件不响应ABA信号。有报道表明， ABA响应元件ABRE和CE3在单子叶植物水稻和双子叶植物拟南芥中具有不同分布模式：ABRE-ABRE元件(ABRC)在两个植物基因组中均较为常见，而拟南芥基因组中几乎没有CE3元件存在，而在水稻基因启动子中可检测到ABRE和CE3元件基序的组合模式。基于上述分析，推测在拟南芥中可能缺少可以结合ABRE-CE3元件的转录因子，导致ABRE-CE3-ABRE元件无法在拟南芥中响应ABA激素[30]，可通过实验进一步进行探究。

本研究从基因和启动子两个层面，初步阐释了ApY2SK2基因在干旱、渗透、盐、低温和ABA激素调控下应答模式。并发现了关键顺式调控元件ABREs的胁迫和激素应答模式，后续可通过酵母单杂交筛选关键转录因子，进一步探究ApY2SK2启动子在种胚发育过程中和逆境胁迫及激素处理下的转录调控功能。