Ⅰ群4型禽腺病毒感染鸡阳性血清的制备及其在IFA中的应用

罗乃杰 赖汉漳 刘玲 盘伟岚 王小芬 梁慧婷 陈潮锦 于亚南 陈瑞爱

摘 要：用LMH细胞扩繁I群禽腺病毒血清4型（FAdV-4）并通过口服途径感染24周龄SPF公鸡，心脏无菌采血制备鸡抗FAdV-4血清。通过ELISA、AGP、IFA和HI等方法检测血清，结果未见其他禽类常见病毒抗体。该血清用于间接免疫荧光检测FAdV-4，染色效果较好，测定FAID₅₀敏感性高。试验结果表明，该批血清2000倍稀释可以作为一抗用于FAdV-4毒价检测。

关键词：FAdV-4;阳性血清;间接免疫荧光试验;FAID50

中图分类号：S858.31 文献标识码：B文章编号：1673-1085（2021）8-0045-05

禽腺病毒（FAdV）属于腺病毒科禽腺病毒属，为无囊膜的双股DNA病毒，可引起禽类心包积液综合征、包涵体肝炎、鸡胃糜烂等多种疾病，是当前危害我国养禽业的主要致病原之一^[1-2]。I群禽腺病毒血清4型（FAdV-4）可引起鸡心包积液肝炎综合征（HPS），临床特征为心包积液和肝脏肿大发炎，该病发病急，传播速度快，死亡率高，给养禽业带来了严重的经济损失^[3]。FAdV-4主要利用LMH细胞进行体外培养，病变特征为细胞变圆聚集，但是健康LMH贴壁细胞本身容易聚团变圆与病变细胞混淆，影响了病毒鉴定和TCID₅₀的测定。基于特异抗体的间接免疫荧光法（IFA）可更客观的鉴别被感染的细胞，但目前只有少数单位开发出禽腺病毒单克隆抗体^[4]，且尚未普及应用，众多研发机构和养禽企业仍然依靠细胞病变结合PCR法来判断病毒感染与否。若将培养的病毒注射免疫SPF鸡制备阳性血清开展IFA，容易产生细胞等其他培养成分的抗体，从而出现非特异性荧光，干扰判读。因此，需要制备特异性好的阳性血清为开展基于IFA 法检测FAdV-4以及准确测定病毒含量提供有效手段。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 贴壁LMH细胞，由肇庆大华农生物药品有限公司保存。

1.1.2 病毒 I群禽腺病毒血清4型（FAdV-4）毒株，由肇庆大华农生物药品有限公司纯化、鉴定和保存。

1.1.3 荧光二抗 FITC标记的兔抗鸡IgG，购自Sigma公司。

1.1.4 鸡抗体检测试剂盒 IBV抗体、ILTV抗体、AEV抗体、IBDV抗体、ALV抗体、REO抗体、CAV抗体ELISA检测试剂盒，均购自IDEXX公司。

1.1.5 细胞培养液 高糖DMEM培养基、胰酶，购自Gibco公司;胎牛血清，购自德国Serana公司。

1.1.6 SPF鸡 24周龄公鸡，购自大华农生药SPF实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 血清制备

1.2.1.1 FAdV-4病毒液制备 取FAdV-4病毒接种于LMH单层细胞，37 ℃吸附1 h后加入含2%血清的DMEM维持液，37 ℃培养5 d，反复冻融3次后2000 g离心5 min，收集上清。

1.2.1.2 动物免疫及采血 取1.2.1.1制备的FAdV-4病毒液，用无菌PBS稀释10倍，通过口服途径感染10只24周龄SPF公鸡，1 mL/只，在隔离器中饲养观察28 d，期间出现死鸡则剔除处理，感染后第28天，仍然存活的鸡全部经心脏无菌采集血液，分离血清后混合，留小样待检。

1.2.2 外源病毒抗体检测 应用 ELISA、AGP、IFA和HI等方法对阳性血清样品进行特异性检定，检测除Ⅰ群禽腺病毒以外13种常见禽类外源病毒的抗体。

1.2.3 间接免疫荧光效价测定

1.2.3.1 细胞板的制备 将对数生长期的LMH细胞铺到96孔细胞培养板中，置培养箱中培养至汇合度60%～80%。将FAdV-4病毒液用DMEM做10倍梯度稀释（10-1～10-10）后接种到96孔板，每孔接种100 μL，设两列空白对照。置37 ℃、5%CO₂培养箱孵育，1 h后添加100 μL含2%胎牛血清DMEM至 200 μL维持，然后置培养箱中培养6 d。

1.2.3.2 间接免疫荧光实验（IFA） 将已接毒细胞板弃去培养液，PBS清洗3次，每孔加入50 μL冷甲醇（-20 ℃），置室温固定15 min，弃去甲醇，自然晾干后，用PBS洗细胞面1次，然后每孔加入50 μL用PBS进行100倍稀释的阳性血清，同时设阴性对照（非接毒细胞加阳性血清）和空白对照（接毒细胞加PBS），置37 ℃作用1 h。用PBST清洗3次，每孔加入50 μL用PBS进行200倍稀释的FITC标记的兔抗鸡IgG，置37 ℃作用1 h。弃去荧光二抗染料，用PBST清洗3次后用熒光显微镜观察。

1.2.3.3 阳性血清最适工作浓度的确定 将制备的阳性血清用PBS进行1∶1000、1∶2000、1∶3000和1∶4000稀释，按照拟定的方法进行间接免疫荧光染色。

2 结果及分析

2.1 制备阳性血清

口服途径接种稀释后的FAdV-4培养物上清，10只SPF鸡在7 d内陆续死亡3只，其余7只至接种后第28 天仍然存活，说明降低接种物中的FAdV-4病毒含量、使用大日龄的SPF公鸡可以减少动物急性死亡，有利于延长病毒在机体繁殖和刺激免疫系统时间，提高血清抗体效价。

2.2 阳性血清特异性检定

使用ELISA、AGP、IFA和HI等方法检测制备的阳性血清样品，结果如表1所示，各项检测结果均为阴性，说明该血清样品具有良好的特异性。

2.3 阳性血清IFA效价测定

将制备的抗FAdV-4阳性血清稀释100倍后用于IFA检测，阳性细胞可见绿色荧光，表明阳性血清对FAdV-4感染的LMH细胞具有特异性，但是背景过重不利于观察判断。将阳性血清用PBS进行1∶1000、1∶2000、1∶3000和1∶4000稀释后进行IFA检测，探索最适工作浓度，结果表明1∶1 000～1∶3000稀释度染色阳性对照清晰，健康细胞对照背景良好，1∶4 000 稀释度荧光不明显。考虑到保存和使用过程中可能造成血清抗体效价出现下降，综合上述结果，确定该 FAdV-4阳性血清用于IFA试验时作为一抗的稀释度为1∶2 000。

3 讨论与小结

间接免疫荧光试验（IFA）是一种利用抗原抗体的免疫学反应对组织或细胞内的抗原进行定位，该方法操作简单、敏感性高、特异性好，在病毒定位与分布、致病原诊断、致病机理研究中得到了广泛应用^[5]。

本研究通过口服途径来降低免疫剂量和使用24周龄的大日龄SPF鸡。其中有7只至接种后第28天仍然存活，留样用PCR检查确认已无FAdV病毒，说明降低接种物中的FAdV-4病毒含量、使用大日龄的SPF公鸡可以减少动物急性死亡，有利于延长病毒在机体繁殖和刺激免疫系统时间，提高血清抗体效价。

李俊平等也曾使用滴鼻、点眼和肌肉注射途径免疫SPF鸡制备REV阳性血清开展IFA^[6]，发现若将培养的病毒培养物注射免疫SPF鸡制备阳性血清开展IFA，容易产生细胞等其他培养成分的抗体，从而出现非特异性荧光，干扰判读。本研究通过将FAdV-4病毒培养上清通过口服途径感染SPF鸡制备阳性血清，尽可能避免了病毒抗原以外成份抗体的产生。

本试验制备了一批鸡抗FAdV-4血清，经检测，血清中未检出鸡痘病毒、传染性法氏囊病毒、马立克氏病病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感病毒（H₅、H₇、H₉）、传染性喉气管炎病毒、禽呼肠孤病毒、产蛋下降综合征病毒、禽白血病病毒J亚群、禽白血病病毒AB亚群、禽脑脊髓炎病毒、网状内皮组织增生症病毒等13种常见禽类外源病毒的抗体，具有良好的单一特异性。 间接免疫荧光抗体效价为1︰3000，综合考虑确定该批血清用于FAID₅₀时1︰2000稀释作为一抗。细胞病变结合PCR法虽然作为现在一种通用的检测方法，技术成熟，快速简便，但用在测定病毒效价时，其测得的病毒效价比实际病毒效价偏低^[7]。用IFA法检测FAdV-4的TCID₅₀，只要在孔内检测到一个阳性，就可以判定为阳性，敏感性高。

本研究制备了鸡抗FAdV-4阳性血清，技术路线简单、非特异荧光背景弱、检测成本低，为开展基于IFA法检测FAdV-4以及准确测定病毒含量提供了有效手段。

参考文献：

[1] 刘吉山，孙培姣，于雪，等. I群禽腺病毒检测方法的研究进展[J].中国兽医学报，2020，40（3）：654-659.

[2] 于新友，李天芝. 鸡Ⅰ群禽腺病毒病的流行与防控[J]. 养禽与禽病防治，2018（12）：36-40.

[3] 张云丹，杨源，王军，等. Ⅰ群禽腺病毒血清4型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用[J]. 西北农业学报， 2019， 28（6）： 868-876.

[4] 王萍，王伟康，梁广成，等. 抗血清4型禽腺病毒纤突蛋白2的单克隆抗体研制及其部分特性研究[J]. 中国家禽， 2017， 39（19）： 27-31.

[5] 朱蕴暖，张鑫，朱向东，等. 猪传染性胃肠炎病毒间接免疫荧光检测方法的建立[J]. 中国兽医科学，2017，47（1）：109-113.

[6] 李俊平，杨承槐，李启红，等. 鸡抗REV血清的制备与鉴定[J]. 中国兽药杂志，2011，45（9）：15-18.

[7] 王林山，尹燕博，邹勇，等. PCR和IFA测定猪圆环病毒2型半数细胞培养感染量的比较[J]. 上海农业学报，2013， 29（1）： 34-38.

Preparation of Chicken Anti- Serotype 4 Fowl Adenovirus Group Ⅰ Polyclonal Antibody and its Application in IFA

LUO Naijie1， LAI Hanzhang1， LIU Ling1， PAN Weilan1， WANG Xiaofen1，

LIANG Huiting1， CHEN Chaojin1， YU Yanan1， CHEN Ruiai1，2*

（1.Key Laboratory of Biotechnology and Bioproducts Development for Animal Epidemic Prevention， Ministry of Agriculture，P.R.China，Guangdong Enterprise Key Laboratory of Biotechnology R&D of Veterinary Biology Products，Zhaoqing Dahuanong Biology Medicine CO.，LTD，Zhaoqing 526238 ， China;

2. College of Veterinary Medicine，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China ）

Abstract： The 24 weeks old SPF chickens were immunized with FADV-4 amplified using LMH cells by Oral route. Chicken anti-FADV-4 serum was prepared by cardiac sterile blood collection. The collected chicken antisera were free of 13 kinds of foreign antibody by ELISA，IFA，AGP or HI. Using the serum to detect FADV-4 by IFA， the staining effect was excellent， and the FAID50 was sensitive. The studies showed that the polyclonal antibody diluted 2000 times can be used as primary antibody in IFA to detected FADV-4 .

Keywords： FAdV-4; antisera; IFA; FAID50

收稿日期：2021-07-20

作者簡介：罗乃杰（1988-），男，本科，生物技术助理工程师，主要从事畜禽疾病防控技术研究及细胞生物反应器培养技术研究，E -mail：972634506@qq.com。

*通讯作者：陈瑞爱（1970-），女，教授，高级兽医师，主要从事动物医学及生物制品研究，E-mail：chensa727@yahoo.com.cn。