不同作用机制杀菌剂对燕麦炭疽病病菌的室内毒力测定

高 鹏，刘 琳，刘昀鑫，魏江铭，李 瑶，赵 祥

（山西农业大学草业学院，山西 太谷 030801）

燕麦(Avena sativa)是世界范围内广泛种植的粮饲兼用植物。随着我国推动粮经饲统筹和草牧业的快速发展，燕麦种植面积逐年扩大，但病害问题成为限制其生产的瓶颈[1]。山西晋北地区是我国饲用燕麦的主产区之一，2018 – 2020年，本研究通过对该地区燕麦病害调查发现，由禾谷炭疽菌(Colletotrichum cereale)引致的炭疽病呈现持续暴发流行的特点，病田率和病株率高达100%，导致大量叶片枯黄，严重时引起植株早衰，造成严重减产[2-3]。

炭疽菌属(Colletotrichum) 亦称刺盘孢属，为半知菌类真菌，其无性态可产生大量直或弯曲的分生孢子。目前已发现部分种的有性态为子囊菌门(Ascomycota)小丛壳科(Glomerellaceae) 小丛壳属(Glomerella)真菌[4]。禾谷炭疽菌的分生孢子呈镰刀形，次生分生孢子部分变直，其有性态尚不清楚。在大于90%的空气湿度或水滴中，分生孢子可萌发产生黑褐色、卵圆形或近圆形的附着胞[2]，然后发展形成侵染钉侵入寄主角质层或皮层，通过初生菌丝和次生菌丝在寄主叶肉细胞内扩展，同时分泌细胞壁降解酶，杀死寄主细胞获取营养，最后在叶表产生分生孢子盘和分生孢子，借助风雨进行侵染循环[5-6]。

禾谷炭疽菌引致的炭疽病是燕麦的主要病害之一，除山西省，在美国、巴西和加拿大以及中国的内蒙古自治区和甘肃省等燕麦主产区均有报道[1,7]。传统控制植物病害的方法包括抗病品种选育、生物防治、改善农业措施和化学防治等。不同防治方法各有利弊，化学防治具有见效快、防效显著、操作简便和成本较低等特点，但也容易使病原菌产生抗药性，对环境和食品安全造成一定危害[8]。因此，掌握杀菌剂的安全用药方法，科学、合理地选择多种作用机制的杀菌剂，是有效防治病害的关键[9]。

19 世纪七八十年代，铜制剂和硫磺等无机和金属类杀菌剂问世以来，取代苯类、二硫代氨基甲酸酯类、苯并咪唑类、三唑类、甲氧基丙烯酸酯类和酰胺类等不同作用机制的有机杀菌剂相继创制[10]，在防控作物病害、提高全球作物产量、改善人类食品安全和健康状况等方面发挥重要作用[8]。但目前尚未见对燕麦产区炭疽病采取防治措施，和关于化学杀菌剂防治燕麦炭疽病的相关报道。鉴于此，本研究通过前期试验初步分析了7 大类12 种杀菌剂对禾谷炭疽菌的抑菌效果，发现除腐霉利和异菌脲等酰胺类杀菌剂外，其余6 大类10 种杀菌剂均有显著防效，本研究将进一步对其抑制菌落生长和孢子萌发的效果进行测定，以期筛选出不同作用机制的高效低毒杀菌剂，为燕麦炭疽病的田间防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试培养基和菌种：马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，PDA) 培养基，马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉17 g，蒸馏水定容到1 L。禾谷炭疽菌菌种分离自山西省大同市天镇县的燕麦炭疽病病株，使用单孢分离法纯化后于4 ℃冰箱中保存，菌落及分生孢子萌发特征如图1 所示。在PDA 培养基上活化30 皿并置于23 ℃培养箱中黑暗培养7 d，用于接种和制备孢子悬浮液。

图1 燕麦炭疽病菌菌落(a)、分生孢子(b)、芽管(c)、附着胞(d)和菌丝(e)Figure 1 The colony (a), conidium (b), germ tube (c), appressorium (d), and hypha (e) of Colletotrichum cereale on oat anthracnose

供试杀菌剂：供试的10 种杀菌剂均为农资市场购买，杀菌剂类型根据杀菌剂抗性行动委员会(FRAC) 2010年分类目认定[11]，各杀菌剂的剂型、类型、生产厂家如表1 所列。

表1 供试杀菌剂的基本信息Table 1 Information on the fungicides used in this study

分别采用菌丝生长速率法和液滴法，在预试验的基础上，确定各杀菌剂抑制菌丝生长和孢子萌发的供试浓度，每种杀菌剂设置5 个梯度供试浓度(表2)。

表2 供试杀菌剂抑制菌丝生长和孢子萌发的梯度供试浓度Table 2 Fungicide concentrations for sensitivity assays with mycelial growth and spore germination of Colletotrichum cereale on oat anthracnose

1.2 试验方法

1.2.1 含药培养基的制备

在超净工作台中，使用微量电子天平或移液器称量对应质量或体积的杀菌剂放入灭菌锥形瓶中，使用灭菌量筒量取无菌水，将各杀菌剂配制成最大供试浓度的10 倍液，然后将10 倍液依次按1/2 倍稀释，获得供试浓度的10 倍液。充分摇晃锥形瓶，使药剂混匀。使用灭菌移液器分别量取1 mL 供试浓度的10 倍液加入9 mL 约50 ℃的PDA 培养基中充分混匀。每个浓度设4 个重复，以等量无菌水处理作为对照。

1.2.2 接种和菌落测量

用直径为5 mm 的打孔器在培养7 d 的禾谷炭疽菌菌落边缘打孔，菌丝一面向下放置在制备好的含药培养基中央，每皿接种一个菌饼，置于23 ℃恒温黑暗培养箱中培养。培养至第6 天时，采用十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长抑制率。

菌丝生长抑制率 = [(对照菌落直径 − 处理菌落直径) / (对照菌落直径 − 菌饼直径)] × 100%。

1.2.3 孢子悬浮液的制备

选择培养7 d 的禾谷炭疽菌菌落，用灭菌毛笔将培养基表面的菌丝轻轻刮下，无菌水冲洗3 次，5 层无菌纱布过滤，用血球计数器将孢子浓度调至1 × 105个·mL−1。

1.2.4 孢子萌发的测量

将长 × 宽 × 高为7.5 cm × 2.5 cm × 0.5 cm、中央凹孔直径1.6 cm、深度0.2 cm 的灭菌单凹载玻片放入底部平铺2 张灭菌滤纸，并放入用5 mL 无菌水浸透的培养皿中。使用灭菌移液器吸取0.09 mL 孢子悬浮液和0.01 mL 供试浓度的10 倍液，置于单凹载玻片凹槽中充分混匀，将培养皿封口并置于23 ℃培养箱中黑暗培养。在培养12 h 时，在显微镜下观察分生孢子的萌发情况。随机观察100 个孢子，统计萌发的孢子总数，当芽管或菌丝长度超过孢子直径的1/2，或产生附着胞时视为萌发(图1)。计算孢子萌发率和孢子萌发抑制率。每个浓度设4 个重复，以等量无菌水处理作为对照。

孢子萌发率 = (萌发的孢子数 / 孢子总数) × 100%；

孢子萌发抑制率 = [(对照孢子萌发率 − 处理孢子萌发率) / 对照孢子萌发率] × 100%；

1.3 统计分析

采用SPSS 23.0 进行数据统计分析。将抑制率转换为机率值，以各杀菌剂供试浓度的对数为自变量，对应的抑制率机率值为因变量，进行线性回归，获得毒力回归方程并计算有效中浓度(EC50)。使用每种杀菌剂的毒力回归方程计算抑制率实测值对应的预测值，并进行χ2检验，获得相关参数，评估实测值和预测值之间的差异显著性。

2 结果与分析

6 大类10 种杀菌剂对燕麦炭疽病菌菌丝生长均有一定抑制作用，通过对毒力回归方程进行拟合，经χ2检验，发现抑制率的预测值和实测值之间差异显著(P> 0.05)，因此对EC50的估测值具有统计学意义。其中，50%多菌灵可湿性粉剂、25%丙环唑乳油、25%嘧菌酯悬浮剂和25%吡唑醚菌酯悬浮剂对禾谷炭疽菌菌丝生长的抑制作用最强，EC50分别为0.092 1、0.877 4、0.118 0 和0.002 9 mg·L−1；70%甲基硫菌灵可湿性粉剂、75%百菌清可湿性粉剂和43%戊唑醇悬浮剂的抑制作用次之，EC50分别为1.755 1、2.576 9和1.537 1 mg·L−1；80%代森锰锌可湿性粉剂、50%福美双可湿性粉剂和25%溴菌晴可湿性粉剂的抑制作用较弱，EC50分别为10.690 5、4.753 4和5.628 6 mg·L−1(表3)。

表3 不同类型杀菌剂对燕麦炭疽病病菌菌丝生长的毒力测定Table 3 Indoor toxicity tests of various fungicides against mycelial growth of Colletotrichum cereale on oat anthracnose

当75%百菌清可湿性粉剂浓度大于0.800 0 mg·L−1时，孢子萌发抑制率均为100%；小于0.800 0 mg·L−1时，对孢子萌发无显著抑制作用。43% 戊唑醇悬浮剂和25% 丙环唑乳油对孢子萌发均无显著抑制作用。对其余7 种杀菌剂的毒力回归方程进行拟合，经χ2检验，所得抑菌率的预测值和实测值之间差异显著(P> 0.05)，因此对EC50的估测值具有统计学意义。其中，50%多菌灵可湿性粉剂、25%嘧菌酯悬浮剂和25%吡唑醚菌酯悬浮剂对禾谷炭疽菌孢子萌发的抑制作用最强，EC50分别为0.112 4、0.118 4 和0.005 9 mg·L−1；80%代森锰锌可湿性粉剂和50%福美双可湿性粉剂的抑制作用次之，EC50分别为0.755 3和0.792 9 mg·L−1；70%甲基硫菌灵可湿性粉剂和25%溴菌晴可湿性粉剂的抑制作用较弱，EC50分别为3.188 6 和2.185 8 mg·L−1(表4)。

表4 不同类型杀菌剂对燕麦炭疽病病菌孢子萌发的毒力测定Table 4 Indoor toxicity tests of various fungicides against spore germination of Colletotrichum cereale on oat anthracnose

3 讨论

百菌清通过抑制病原菌胞内三磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate)的活性，导致谷胱甘肽(glutathione) 及下游蛋白的合成受阻[12]。代森锰锌和福美双则对含有巯基(-SH)或含有金属的酶活性具有抑制作用[13]。这3 种杀菌剂均具有多位点接触活性且产生耐药性风险较低等优点，是作物和经济植物病害防治中普遍使用的保护性杀菌剂[14]。本研究结果表明，百菌清、代森锰锌和福美双均对燕麦炭疽病菌菌丝生长有显著抑制作用，其中百菌清的EC50最低，为2.576 9 mg·L−1，且远低于对胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和尖孢炭疽菌(Colletotrichumacutatum)的EC50(173.341 0、151.441 0 mg·L−1)[15]。但作为保护性杀菌剂，更需要关注对孢子萌发的抑制效果[13]。本研究未得到百菌清浓度和孢子萌发抑制率的回归方程，但发现当有效浓度≥ 0.800 0 mg·L−1时，对孢子萌发的抑制率达100%。代森锰锌和福美双抑制孢子萌发的EC50相近，分别为0.755 3 和0.792 9 mg·L−1。可见，在相同防效下，百菌清用药量更低。因此在燕麦炭疽病发生前，百菌清可作为防治燕麦炭疽病的保护性杀菌剂。

多菌灵和甲基硫菌灵是以苯丙咪唑环为母体的一类有机杀菌剂，通过与真菌菌丝和孢子芽管中的β 微管蛋白(β-tubulin protein)结合抑制病菌有丝分裂[16]，兼具内吸治疗和保护作用，是较早用于防治植物炭疽病的杀菌剂之一。多菌灵抑制燕麦炭疽病菌菌丝生长的EC50为0.092 1 mg·L−1，低于对禾生炭疽菌(Colletotrichum graminicola)、亚麻刺盘孢(Colletotrichum linicola)和胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)的EC50(0.9569、0.510 9 和0.1740 mg·L−1)[15,17-18]，也低于联合国粮食及农业组织允许的最高限量(0.100 0 mg·L−1)[19]，表明该病原尚未对多菌灵产生抗性。此外，多菌灵对孢子萌发也有显著抑制效果，但孢子对其敏感性较菌丝要低，因此喷施浓度要与孢子抑制浓度相一致，才能同时发挥内吸治疗和保护作用。甲基硫菌灵对燕麦炭疽病菌也具有显著防效，但其EC50明显要高，因此多菌灵更适合用于防治燕麦炭疽病。

戊唑醇和丙环唑为甾醇脱甲基作用抑制剂(sterol demethylation inhibitors，DMIs)，通过干扰或阻断病原菌麦角甾醇生物合成发挥抗菌作用，是目前应用最为广泛的内吸性杀菌剂，对子囊菌和担子菌等真菌引起的多种病害具有显著防效[20]。DMIs 也是目前唯一报道用于防治禾谷炭疽菌(C.cereale)引致多种禾草炭疽病的一类杀菌剂。在美国加州，通过分析禾谷炭疽菌对DMIs 的敏感性，发现戊唑醇和丙环唑抑制菌丝生长的EC50均值分别为0.082 0和0.140 0 mg·L−1[21]，是本研究结果的18.7 和6.2 倍。而该研究同时分析了长期使用DMIs 对禾谷炭疽菌产生抗药性的影响，结果表明，EC50值显著提高了6.5 倍[21]。由此可见，晋北地区燕麦炭疽病菌可能对DMIs 产生了一定的抗药性，在病害防治中应慎重使用。

嘧菌酯和吡唑醚菌酯是近年来创制的一类新型的醌外抑制剂(quinone outside inhibitors，QoIs)，其杀菌作用与真菌细胞色素(cytochrome b，Cytb)BC1 酶复合物Qo 位点的结合密切相关，可抑制线粒体的呼吸及能量释放[22]。孢子萌发是一种高度依赖能量的生理过程，因此大多数分生孢子的线粒体被分配到芽管里[15]，这可能是燕麦炭疽病菌孢子对嘧菌酯和吡唑醚菌酯高度敏感的原因。所有供试杀菌剂中，吡唑醚菌酯是抑制菌丝生长和孢子萌发最有效的杀菌剂，兼具保护和治疗作用，且与已报道对胶孢炭疽菌和平头炭疽菌(Colletotrichum truncatum)的EC50相近[14,23]，尚未产生抗性，因此在燕麦炭疽病的防治中优先使用。

本研究供试的燕麦炭疽菌种分离自晋北地区大同市天镇县的燕麦种植田，对该地区其他市(县)燕麦病害调查发现炭疽病均有发生，但上述地区均未采用喷施杀菌剂防治病害，这可能是导致病菌对供试的大多数杀菌剂尚未产生明显抗性的原因。此外，室内测定结果与田间实际使用防效可能存在差异，有待进一步通过田间试验验证杀菌剂的实际防效。随着该地区燕麦生产规模扩大和种植年限的增加，病害防控形式将愈发严重，建议生产者高度重视炭疽病的流调工作，及时轮换采用不同作用机制的化学杀菌剂防控病害，同时改善种植条件，引进和选育抗病品种，保证燕麦的可持续生产。

4 结论

本研究通过对6 大类10 种杀菌剂抑制菌落生长和孢子萌发效果的测定，证实对燕麦炭疽病菌均具有显著防效，但不同杀菌剂和浓度之间以及对菌丝生长和孢子萌发的抑制效果存在差异。其中多菌灵、丙环唑、嘧菌酯和吡唑醚菌酯对禾谷炭疽菌菌丝生长的抑制作用较强；百菌清、多菌灵、嘧菌酯和吡唑醚菌酯对禾谷炭疽菌孢子萌发的抑制作用较强。根据作用机制的不同，建议百菌清在炭疽病发生前优先作为保护性杀菌剂使用，多菌灵、嘧菌酯和吡唑醚菌酯作为保护和治疗性杀菌剂使用。