柠檬酸添加剂对圆叶决明青贮饲料营养品质与发酵特性的影响

韩雪林，史文娇，张 娟，张 磊，李苏涛，冯启贤，阳伏林

（福建农林大学动物科学学院(蜂学学院)，福建 福州 350002）

圆叶决明(Chamaecrista rotundifolia)为豆科多年生草本植物，草质柔软，营养价值丰富(与南方广泛应用的豆科牧草接近)，是一种新发现的饲、肥兼用的牧草[1-2]。圆叶决明具有较强的抗逆性、适应性和再生性，并且既耐旱又耐高温、病虫害少，对环境条件要求低，在营养匮乏和酸性环境中生长良好，固氮能力强，适宜在南方进行大面积种植[3-4]。在饲喂草食性动物的过程中发现圆叶决明对其生长发育及生理变化等有显著的促进作用，诸多养殖场已投入生产实践[1,5-6]。但新鲜的圆叶决明牧草含有碱性物质、味甘、单宁含量高、适口性差[7]，且南方多雨，草料储存易受湿热环境影响发霉变质，因此对圆叶决明进行青贮处理不仅能改善饲料适口性，而且能够延长保存时间。酸度是影响青贮饲料的一个重要因素，适宜的酸度能很好地调节青贮饲料的适口性，而酸度过低会有酸涩等现象[8]。柠檬酸(citric acid, CA)是一种应用广泛的酸化剂和抗氧化剂，比青贮饲料中常用的甲酸和乙酸更安全[9]，可通过微生物发酵获得，生产成本低[10]。发酵过程中，CA 能迅速降低pH，抑制霉菌、酵母菌等不良菌群的繁殖活动，提高青贮发酵品质[11]；同时CA 作为发酵底物，为乳酸菌提供碳源，促进乳酸菌生长[12]；此外，乳酸菌能将CA 代谢生成具有香味的双乙酰和乙酸等物质[13-14]，可改善青贮饲料适口性。目前，国内对圆叶决明的研究还停留在套作、品种选育上，对其青贮技术的研究还未见报道，因此开发圆叶决明青贮技术，在畜牧生产中的应用具有巨大的意义和价值。

本研究主要通过添加不同水平CA 对圆叶决明进行不同天数的青贮发酵，分析比较圆叶决明青贮发酵前后的营养价值，评定发酵品质，阐明CA 及不同发酵程度对圆叶决明青贮品质的影响，为圆叶决明在饲养生产上更好的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用采自福建省漳州市漳浦县万安农场的结荚期圆叶决明作为青贮原料，距离地面8～10 cm 处进行刈割。添加剂柠檬酸(AR ≥ 99.0%)阿拉丁，购于福州麦力生物科技有限公司。

1.2 试验设计

试验共分为5 个试验组和3 个青贮时间处理。5个试验组分别添加0(CK)、0.1% (Ⅰ)、0.3% (Ⅱ)、0.5% (Ⅲ)、1.0% (Ⅳ)的CA，CA 添加量为占青贮原料鲜重(fresh matter, FM)百分比(25 mL·kg−1)，CK 组加等量蒸馏水。设置青贮时间30、45 和60 d，每个试验组每个青贮时间处理各3 个重复。

1.3 试验方法

1.3.1 青贮样品的制备

将采集的圆叶决明鲜草样室温存放晾晒至24 h，用铡草刀切成1～2 cm 小段，切碎后混合均匀。按试验设计将添加剂或蒸馏水(CK)均匀喷洒在每个处理的2 kg 样品上，充分混匀后，迅速分装入青贮袋中，每袋约400 g，抽出空气达到真空状态后封口，室温存放发酵30、45 和60 d 后测定化学成分及发酵指标含量。

1.3.2 测定指标与方法

基本营养物质指标：青贮30、45 和60 d 后每个处理各随机抽取3 袋开封，将样品混合均匀后，取200 g 样品65 ℃烘箱中烘至恒重，测定干物质(dry matter, DM)含量、测定粗蛋白(crude protein, CP)含量参考标准(GB/T 6432-2018)、中性洗涤纤维(neutral detergent fiber, NDF)含量(GB/T 20806-2006)、酸性洗涤纤维(acid detergent fiber, ADF)含量和水溶性碳水化合物 (water soluble carbohydrate, WSC)含量[15]。

青贮发酵特性分析：取10 g 代表性样品放入250 mL 锥形瓶中加入90 mL 蒸馏水，4 ℃冰箱浸提24 h 后，4 层纱布和定性滤纸过滤，一部分滤液用于测定pH[16]，每个样品重复测定3 次；另一部分通过0.22 μm 的滤筛过滤后分装，−20 ℃保存，用于测定氨态氮[17](NH3-N) 、有机酸[乳酸(lactic acid, LA)、乙酸(acetic acid, AA)和丙酸(propionic acid, PA)]含量[18]。

1.4 数据分析

使用Excel 2013 整理试验数据，用SPSS 20.0 进行单因素和双因素方差分析与多重比较。

2 结果与分析

2.1 圆叶决明鲜草营养成分

圆叶决明鲜样中DM 含量为25.00%，干样中的CP 含量为18.08%、NDF 含量为60.49%、ADF 含量为41.18%、WSC 含量为3.50%，鲜样pH 为6.07。

2.2 不同柠檬酸水平及发酵时间对圆叶决明青贮饲料营养品质的影响

CA 对圆叶决明青贮各营养指标影响显著(P<0.05)，除DM 外发酵时间对其他营养指标影响显著(P< 0.05)。柠檬酸和发酵时间的交互作用对NDF和ADF 含量影响显著(P< 0.05)，对其他营养指标影响不显著(P> 0.05)。青贮30 d 时，圆叶决明有较高的DM 含量，Ⅳ处理组最高，为27.21% (表1)。青贮30、45 和60 d 时，CP 含量均以Ⅳ组最高，分别为16.94%、16.51%和15.64%，显著高于CK 组(P< 0.05)，但青贮30 d 与45 和60 d 间差异不显著(P> 0.05)。随着青贮周期的延长，NDF 和ADF 含量呈先升高后下降趋势。青贮30、45 和60 d 时，Ⅳ组的NDF和ADF 含量均显著低于CK 组，其中，NDF 含量分别降低4.64%、5.29% 和2.13%；ADF 含量分别降低2.39%、2.49%和1.72%。青贮60 d 时，各处理NDF 和ADF 含量最低，且均以Ⅳ组最低，分别为54.25%和40.94%；各处理NDF 含量与30 和45 d相比差异显著(P< 0.05)，CK 组和Ⅰ组的ADF 含量与30 和45 d相比差异显著(P< 0.05)。CA 对圆叶决明WSC 含量无显著作用(P> 0.05)，青贮30、45 和60 d 时，均以Ⅳ组的WSC 含量最高，其中，青贮30 d 的Ⅳ组最高，为1.33%。

表1 不同处理及发酵时间对圆叶决明青贮饲料营养品质的影响Table 1 Effects of different treatments and fermentation times on the nutrient composition of Chamaecrista rotundifolia silage

2.3 不同柠檬酸水平及发酵时间对圆叶决明青贮饲料发酵特性的影响

CA 及发酵时间对圆叶决明各发酵指标均有影响显著(P< 0.05)，二者的交互作用对圆叶决明青贮NH3-N/TN 及PA含量影响显著(P< 0.05)，对pH、LA 和AA 含量无显著性影响(P> 0.05)。在各青贮周期中，随着CA 含量的增加各处理圆叶决明青贮pH 均呈下降趋势。与CK 组相比，其他试验组pH 显著降低(P< 0.05)，且pH 均在5.0 以下。各青贮期试验组NH3-N/TN 均显著降低(P< 0.05)，且均以Ⅳ组的NH3-N/TN 最低，分别下降了2.89%、3.78%和3.60%。青贮30 d 时NH3-N/TN 显著低于60 d (P<0.05)，且Ⅳ组的NH3-N/TN 最低，较60 d 时低0.53%。各试验组LA 含量均显著高于CK 组(P< 0.05)，但各试验组间差异不显著(P> 0.05)。各处理组均以青贮30 d 时LA含量最高。青贮30 和45 d，Ⅲ组的AA 含量显著低于CK 组和试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ组(P<0.05)。青贮60 d 时，Ⅲ和Ⅳ组的AA 含量显著低于CK 组(P< 0.05)。各试验组PA 含量均显著低于CK组(P< 0.05)，青贮30、45 和60 d 时，Ⅲ组的PA 含量均最低(P< 0.05)，但各青贮期PA 含量差异不显著(P< 0.05) (表2)。

表2 不同处理及发酵时间对圆叶决明青贮饲料发酵特性的影响Table 2 Effects of different treatments and fermentation times on the fermentation characteristics of Chamaecrista rotundifolia silage

3 讨论

3.1 柠檬酸及发酵时间对圆叶决明青贮饲料营养品质的影响

DM 含量不仅决定了青贮饲料中营养物质含量，更是青贮发酵启动的关键因素。青贮过程中，由于植物细胞的呼吸作用及微生物发酵，会造成青贮原料DM 损失[19]，酸性添加剂能加速饲料酸化，抑制蛋白降解和有害菌的繁殖活动，减少青贮过程中饲料营养物质的损失[20]。本研究中，各试验组DM含量均高于CK 组，当CA 添加量为1.0%时，DM 含量最高，这说明CA 的添加为青贮提供了额外的发酵底物，同时形成的酸性坏境抑制了有害菌的活性，青贮原料DM的损耗降低。经CA处理后能提高WSC浓度，这与张晴晴等[21]在燕麦(Avena fatua)青贮发酵中添加有机酸后WSC 含量高于CK 组的结果基本一致。青贮期对圆叶决明WSC 的消耗较低可能是因为有机酸CA 本身提供了额外发酵底物，同时有机酸的添加得到较低的pH，抑制了青贮期不良菌群的繁殖活动[22-23]。各试验组圆叶决明青贮CP 含量升高，Ke 等[16]在苜蓿青贮中添加不同浓度柠檬酸后蛋白含量增加且随添加量不断增加蛋白含量上升，这与本研究结果一致。这说明添加CA 能抑制青贮料蛋白质的降解。饲料中纤维含量越高，青贮发酵越难，青贮料适口性越差。本研究中，CA 处理显著降低了圆叶决明中的NDF 和ADF 含量。这与Zi 等[24]在王草(Pennisetum purpureum)青贮中添加柠檬酸及随青贮时间的延长青贮料的NDF 和ADF 含量降低的结果基本一致，这说明CA 有一定的酸化能力，能破坏完整稳定的细胞壁结构，降低圆叶决明纤维含量，提高营养价值[25-26]。Ke 等[22]的研究表明0.5% CA 处理对紫花苜蓿(Medicago sativa)NDF 和ADF 含量无显著影响，而本研究中添加0.5%和1.0%的CA 能够显著降低圆叶决明青贮料的NDF 和ADF 含量，这可能是因为本研究所用的豆科牧草圆叶决明纤维含量较高。由此可见，CA 能够改善圆叶决明青贮营养品质，当添加水平为0.5%和1.0%时，青贮营养品质改善效果最好，且二者之间差异不显著。

青贮营养品质随发酵时间的变化不断变化。除DM 外，发酵时间对其他营养指标均影响显著，随着发酵时间延长，各组DM、CP 和WSC 含量均有不同程度的降低，NDF 和ADF 的含量呈现上下浮动，在青贮60 d 时，各组DM、CP 和WSC 含量与原料相比损耗最多，NDF 和ADF 含量最低。其含量变化与卢强等[27]、张放等[28]和王子苑等[29]报道的青贮料营养成分动态变化规律一致。这说明较长的发酵时间需要更多的底物和能量去维持微生物的生长繁殖、促进发酵的进行，导致青贮料中所残留的DM、CP 和WSC 含量相对降低；青贮原料存放过程中纤维素的部分降解及低pH 对饲料纤维酸化程度更强，造成NDF 和ADF 含量降低。王致敬等[30]研究表明随青贮时间延长凤梨(Ananas comosus)渣青贮CP 含量逐渐增加，与本研究结果不一致，这可能是因为圆叶决明WSC 含量较低，无法满足微生物发酵所需能量，在青贮过程中消耗利用了部分蛋白质，使CP 含量降低。毛翠等[31]的研究中表明玉米(Zea mays)各组随青贮时间延长，NDF 含量增加，ADF 含量降低，与本研究结果不一致，这可能是由全株玉米与本研究所用圆叶决明的类型、添加剂种类及发酵天数不同造成的。因此，不同发酵时间对圆叶决明青贮发酵品质的影响不同，发酵时间越长消耗的底物越多，但消耗的纤维含量越少。

柠檬酸添加剂与发酵时间的交互作用对NDF和ADF 含量影响显著，对其他营养指标影响不显著，这说明二者的交互作用中柠檬酸是影响圆叶决明青贮营养品质的关键因素。发酵时间主要影响纤维成分。

3.2 柠檬酸及发酵时间对圆叶决明青贮饲料发酵特性的影响

青贮饲料pH 在发酵特性评价中起至关重要的作用，低pH 可以抑制不良酵母和霉菌[32]，提升饲料发酵品质。因此，通过添加CA 快速降低pH，抑制不良菌群，提高发酵品质。本研究中，CA 处理组的pH 与CK 组的相比显著降低，且随CA 含量增加pH 不断降低，其值均在5.0 以下，这与Ke 等[16]研究结果一致，说明CA 可促进圆叶决明青贮发酵，为乳酸菌提供发酵底物，增强产乳酸能力，导致青贮饲料pH 降低。但Li 等[33]的研究表明CA 的添加导致紫花苜蓿青贮饲料pH 升高，与本研究的结果不一致，这可能是因为本研究所用圆叶决明与紫花苜蓿相比具有较强的酸度和较低的缓冲能力。NH3-N/TN反映了饲料蛋白降解程度，比值越小说明饲料蛋白保存越好。本研究中CA 的添加显著降低了NH3-N/TN，其中1.0%CA 组NH3-N/TN 最低，这一结果与He 等[34]和Ke 等[16]的研究结果一致，这是因为有机酸的添加降低了pH，抑制了植物蛋白酶的活性和较弱的耐酸细菌及不良微生物发酵，较大程度地保留了蛋白质含量；也可能是因为圆叶决明中的的单宁含量较高，浓缩单宁与蛋白质有较高的亲和力，在饲料发酵过程中保护蛋白质不被降解[35-36]。乳酸是青贮的主要发酵产物，是青贮发酵特性的重要评价指标。CA 的添加降低了青贮环境pH，抑制有害菌的生长，同时为乳酸菌提供能量，加快乳酸菌的生长，促进发酵进程[33]。本研究中，CA 显著提高了圆叶决明青贮料的LA 含量，但不同的添加水平对LA 含量的影响不同，低浓度0.1% 的乳酸含量最高。Ke 等[16]研究表明CA 能显著提高紫花苜蓿青贮LA 含量，且随CA 的增加，LA 含量逐渐降低，这与本研究结果基本一致，说明高浓度的CA 形成较强的酸性环境，抑制了乳酸菌的活性，削弱了乳酸菌产乳酸的能力，进而LA 含量降低。青贮后AA 和PA 含量降低，当CA 水平为0.5%时AA 和PA 含量最低(P< 0.05)，Li 等[37]的研究表明当CA 添加量为0.5% 时木薯(Manihot esculenta)的AA 含量基本不变，PA 含量显著低于对照组。这可能是因为本研究所用的圆叶决明与木薯叶营养成分不同，CA 对其的作用也有差异，同时CA 可以直接酸化饲料，快速形成酸性环境，抑制乳酸菌对乳酸和柠檬酸的作用，降低了乙酸含量[38-39]。由此可见，青贮中添加CA 能提高圆叶决明发酵品质，当CA 添加量为0.5%时效果最佳。

青贮30、45 和60 d 时CK 组的pH 无显著变化，且高于5.0，这说明圆叶决明很难直接青贮，发酵天数对其单独青贮无显著性影响。随发酵时间延长，能观察到随CA 含量的增加不同发酵时间段对青贮料pH 的影响降低，说明CA 水平与发酵天数的交互作对pH 的影响不显著。圆叶决明青贮NH3-N/TN随青贮周期延长不断升高，这在贾戌禹等[40]的研究中得到相似的结果。随着CA 添加量的增加NH3-N/TN 随青贮周期延长升高的比例越来越小，这说明微生物发酵随青贮期延长，消耗更多的底物，蛋白质降解相对增多，但CA 水平与发酵天数的交互作用减少了NH3-N 的产生，有效保留了青贮料CP 含量。青贮过程中LA 含量呈下降趋势，在青贮45 和60 d 后LA 含量降低且差异不显著，可能是因为青贮30 d 时乳酸的大量积累，抑制了后期乳酸菌的活性，减少了乳酸的产生[41]。但Lyu 等[42]报道随青贮时间延长阳春砂(Fructus Amomi)青贮料中LA 含量逐渐升高，与本研究结果不一致，这可能是本研究所用的圆叶决明为豆科牧草，阳春砂为姜科植物，两种研究用草类型及青贮时长不一样所致。青贮料AA 含量随发酵天数的增加有波动，但整体呈现下降趋势，这与邹诗雨等[43]和刘桂要[44]的研究结果不一致，可能是因为在青贮60 d 时，青贮料的pH 过低，抑制了醋酸菌的活动，减少了AA 的产生。PA 具有抑菌作用，在青贮原料中含量较低[45]。在青贮30 和45 d 时PA 含量呈下降趋势，但在青贮60 d 时，PA 含量显著升高，与陈鑫珠等[46]在不同发酵时间对菌糠发酵品质的研究中发现发酵60 d 后PA 含量显著升高的结果一致。总体来看，不同发酵时间对圆叶决明发酵特性的影响不一，青贮时间短，发酵特性较好。

本研究中，柠檬酸与发酵时间的交互作用对圆叶决明pH、LA 和AA 无显著影响，但柠檬酸是影响青贮pH、LA 和AA 含量的主要因素，青贮时间对NH3-N/TN 和PA 的影响显著。

4 结论

添加CA 后能够有效改善圆叶决明青贮品质，在CA 添加量为0.5%和1.0%时圆叶决明青贮营养品质效果最好，CA 添加量为0.5%时圆叶决明发酵特性效果最佳；柠檬酸与发酵时间的交互作用显著影响了NDF、ADF、NH3-N/TN 和PA 含量，对其他指标无显著影响。综合经济、安全、环保等因素，在圆叶决明青贮时，当CA 添加量为0.5%、青贮时间为30 d 时，其青贮品质效果最佳。