张氏消肿定痛膏透皮吸收物质基础研究

徐长琼 ，李然 ，任秋芸 ，梅君 ，黎珊 ，黄会保，夏丽琼

（1.岳阳市妇幼保健院科研所，湖南岳阳 414000；2.汕头大学医学院，广东汕头 515000；3.岳阳市中医医院药剂科，湖南岳阳 414000）

“岳阳张氏正骨术”由张瑞林创立，历经百余年理论发展及实践验证，成为湖湘中医正骨的主流学派，2012 年被国家中医药管理局确定为第一批全国十三大骨伤学术流派传承工作室建设项目，2017 年获评“湖南省非物质文化遗产代表性项目”[1-4]。

“岳阳张氏正骨术”提倡内外相合用药，百余年来积累了多种有效秘方，自拟自制过张氏消肿定痛膏、接骨止痛胶囊等10 余种院内制剂，用于治疗急慢性软组织损伤，临床疗效显著，安全性良好。然而，张氏消肿定痛膏治疗骨伤科疾病的物质基础研究及其外用透皮吸收物质基础研究均未见文献报道，本项目拟使用大鼠离体皮肤，制备张氏消肿定痛膏透皮渗透液，通过UPLC-MS/MS和自建数据库等广泛靶向代谢组学研究平台，研究张氏消肿定痛膏透皮吸收物质基础，了解药物透皮吸收成分及相对含量，明确张氏消肿定痛膏发挥药效作用的物质基础。

1 仪器与试剂

超高效液相色谱（Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A）；串联质谱（Applied Biosystems 6500 QTRAP）；BSA224S-CW 型电子分析天平[（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；ⅩMTD-7000 磁力搅拌器（天津赛得利斯实验分析仪器制造厂）；甲醇、乙腈、乙醇为Merck 色谱纯试剂；标准品（BioBio-Pha/Sigma-Aldrich）；张氏消肿定痛膏由岳阳市中医院骨伤科提供。

2 方法

2.1 供试品的制备

张氏消肿定痛膏原药提取物的制备：取各张氏消肿定痛膏原药0.5 g，置15 mL 离心管中，加甲醇10 mL，超声提取1 h，加甲醇至刻度，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

张氏消肿定痛膏透皮成分的制备：健康SD 大鼠处死后剃毛，剥离大鼠背部皮肤，剔除皮下脂肪以及粘连物，剪成适当大小，-20 ℃保存；用时解冻，生理盐水浸润，自制渗透池，角质层面敷贴张氏消肿定痛膏，真皮层面向接受室，接受池中加10 mL预热生理盐水，37 ℃恒温搅拌，每隔2 h从接受池吸取渗透液后再补加预热生理盐水，重复以上步骤至12 h，即得透皮渗透液（制备过程见图1）。待测液高速离心后取上清液，0.22 μm 微孔滤膜滤过，UPLCMS/MS测定主要成分含量。空白组不加药，用以排除大鼠皮肤及装置物质干扰。

图1 张氏消肿定痛膏透皮渗透液的制备Figure 1 Preparation of osmotic solution of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment

2.2 测定条件

液相条件：色谱柱为Agilent SBC18柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；以超纯水（加入0.1%的甲酸）为流动相A相，乙腈为B相，洗脱梯度（0.00 min，5%B；9.00 min 内，95%B，维持1 min；10.00～11.10 min，5%B；并以5%平衡至14 min）；流速为0.35 mL/min；柱温为40 ℃；进样量为2 μL。

质谱条件：电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）温度550 ℃，质谱电压5 500 V，帘气（curtain gas,CUR）206.85 kPa，碰撞诱导电离（collision-activated dissociation,CAD）参数设置为高。在三重四级杆（QQQ）中，每个离子对是根据优化的去簇电压（declustering potential,DP）和碰撞能（collision energy,CE）进行扫描检测。

2.3 定性定量分析方法

2.3.1 定性分析 基于自建数据库MWDB（metware database），根据二级谱信息进行定性，分析时去除同位素信号，含K+离子、Na+离子、NH4+离子的重复信号，以及本身是其他更大分子量物质的碎片离子的重复信号。

2.3.2 定量分析 利用三重四级杆质谱的多反应监测模式（multiple reaction monitoring，MRM）分析完成。MRM 模式中，四级杆首先筛选目标物质的前体离子（母离子），排除其他分子量物质对应的离子以初步排除干扰；前体离子经碰撞室诱导电离后断裂形成很多碎片离子，碎片离子再通过三重四级杆过滤选择出所需要的一个特征碎片离子，排除非目标离子干扰。获得不同样本的质谱分析数据后，用MultiaQuant软件打开样本下机质谱文件，进行色谱峰的积分和校正工作，每个色谱峰的峰面积（Area）代表对应物质的相对含量，并对其中同一化合物在不同样本中的质谱出峰进行积分校正。

2.4 样本质控分析

质控样本（QC）由样本提取物混合制备而成，用于分析样本在相同的处理方法下的重复性。在仪器分析的过程中，每10 个检测分析样本中插入1 个质控样本，以监测分析过程的重复性。

2.5 数据处理

分类比较透皮吸收物质总数量；将所有检测到的化合物总峰面积相加为100%，然后将每个成分单独色谱峰峰面积/总峰面积，得该峰所对应化合物相对质量分数（%），根据相对质量分数值比较每一类化合物总质量分数和该类化合物分布；每类物质列出相对质量分数大于0.01%或最高的20种化合物。

3 结果

3.1 数据结果评估

利用软件Analyst 1.6.3 处理质谱数据。图2 为样品、混样质控QC 样本的总离子流图（Total ions current，TIC）及MRM 代谢物检测多峰图（多物质提取的离子流谱图，ⅩIC）。通过对不同质控QC 样本质谱检测分析的总离子流图进行重叠展示分析，可见代谢物提取和检测重复性、仪器稳定性良好，数据可靠。

图2 张氏消肿定痛膏UPLC-MS/MS离子流图Figure 2 UPLC-MS/MS ion flow map of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment

3.2 张氏消肿定痛膏及其渗透液中的化学成分

张氏消肿定痛膏中总共检测到542 种化合物（图3，ZSZG），其中黄酮类化合物122 种，酚酸77种，氨基酸及其衍生物42 种，萜类40 种，木脂素和香豆素40 种，有机酸34 种，生物碱33 种，核苷酸及衍生物26 种，脂质25 种，醌类12 种，鞣酸9 种，维生素8种，糖及醇类5种，其他69种。

张氏消肿定痛膏渗透液中总共检测到422种化合物（图3，ZSZG-D），其中酚酸71种，黄酮类化合物75 种，萜类37 种，木脂素和香豆素38 种，有机酸31种，生物碱27 种，氨基酸及其衍生物28 种，醌类10种，核苷酸及衍生物16 种，脂质12 种，鞣酸6 种，其他71种。

图3 张氏消肿定痛膏（ZSZG）及透皮渗透液（ZSZG-D）中化合物分类及数量Figure 3 Classification and quantity of compounds in Zhang's antiswelling (ZSZG) and relieving pain ointment and dialysate(ZSZG-D)

3.3 张氏消肿定痛膏渗透液中化合物的相对质量分数

将同类物质相对百分比相加，计算该类化合物总质量分数（图4），其中生物碱占（6.33±2.10）%，酚酸占（37.83±9.23）%，有机酸占（7.91±2.22）%，黄酮占（5.61±0.60）%，萜类占（3.20±0.92）%，木脂素和香豆素占（3.31±1.03）%，氨基酸及衍生物占（9.99±1.20）%，醌类占（2.05±0.91）%，核苷酸及衍生物占（7.78±1.29）%，脂质占（3.48±0.10）%，鞣酸占（0.13±0.09）%，其他化合物占（12.39±2.91）%。

图4 张氏消肿定痛膏渗透液中化合物分类及总相对质量分数Figure 4 Classification and total relative content of compounds in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment

将同类物质相对质量分数进行统计（图5），其中酚酸平均质量分数较高，但各成分的质量分数差异较大，最高的化合物为绿原酸*（*代表同分异构体，下同）。

图5 张氏消肿定痛膏渗透液中化合物分类及质量分数分布Figure 5 Classification and content distribution of compounds in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment

3.4 张氏消肿定痛膏的主要透皮成分

将每类物质相对质量分数进行排序，选取相对质量分数较高的20 种或大于0.01%的化合物列表。可见氨基酸及其衍生物、酚酸、黄酮、木脂素和香豆素、生物碱、萜类、有机酸、核苷酸及其衍生物、脂质、醌类和鞣质中，质量分数最高的化合物依次为L-精氨酸（表1）、绿原酸*（表2）、6-羟基山柰酚-3，6-O-二葡萄糖苷-7-O-葡萄糖醛酸（表3）、5-甲氧基-8-羟基补骨脂素（表4）、去甲麻黄碱（表5）、獐牙菜苷（表6）、氨基丙二酸（表7）、N6-琥珀酰腺苷（表8）、十六烷基鞘胺醇（表9）、大黄酸-8-O-（6′-O-乙酰基）-葡萄糖（表10）和没食子酸（表11），其他化合物中羟基红花黄色素A质量分数最高（表12）。

表1 张氏消肿定痛膏渗透液中主要氨基酸及其衍生物（前20种）Table 1 Main amino acids and derivatives in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表1 张氏消肿定痛膏渗透液中主要氨基酸及其衍生物（前20种）Table 1 Main amino acids and derivatives in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表2 张氏消肿定痛膏渗透液中主要酚酸类物质（前20种）Table 2 Main phenolic acids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表2 张氏消肿定痛膏渗透液中主要酚酸类物质（前20种）Table 2 Main phenolic acids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表3 张氏消肿定痛膏渗透液主要黄酮类物质（前20种）Table 3 Main flavonoids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表3 张氏消肿定痛膏渗透液主要黄酮类物质（前20种）Table 3 Main flavonoids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表4 张氏消肿定痛膏渗透液中主要木脂素和香豆素（前20种）Table 4 Main lignans and coumarins in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表4 张氏消肿定痛膏渗透液中主要木脂素和香豆素（前20种）Table 4 Main lignans and coumarins in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表5 张氏消肿定痛膏渗透液中主要生物碱（前20种）Table 5 The main alkaloid in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表5 张氏消肿定痛膏渗透液中主要生物碱（前20种）Table 5 The main alkaloid in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表6 张氏消肿定痛膏渗透液中主要萜类化合物（前20种）Table 6 Main terpenoids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表6 张氏消肿定痛膏渗透液中主要萜类化合物（前20种）Table 6 Main terpenoids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表7 张氏消肿定痛膏渗透液中主要有机酸（前20种）Table 7 Main organic acids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表7 张氏消肿定痛膏渗透液中主要有机酸（前20种）Table 7 Main organic acids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表8 张氏消肿定痛膏渗透液中主要核苷酸及衍生物（＞0.01%）Table 8 Main nucleotides and derivatives in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(＞0.01%)(,n=3)

表8 张氏消肿定痛膏渗透液中主要核苷酸及衍生物（＞0.01%）Table 8 Main nucleotides and derivatives in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(＞0.01%)(,n=3)

表9 张氏消肿定痛膏渗透液中主要脂质（＞0.01%）Table 9 Main lipids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(＞0.01%)(,n=3)

表9 张氏消肿定痛膏渗透液中主要脂质（＞0.01%）Table 9 Main lipids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(＞0.01%)(,n=3)

表10 张氏消肿定痛膏渗透液中主要醌类物质（＞0.01%）Table 10 Main quinones in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(＞0.01%)(,n=3)

表10 张氏消肿定痛膏渗透液中主要醌类物质（＞0.01%）Table 10 Main quinones in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(＞0.01%)(,n=3)

表11 张氏消肿定痛膏渗透液中主要鞣质（＞0.01%）Table 11 Main tannins in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(＞0.01%)(,n=3)

表11 张氏消肿定痛膏渗透液中主要鞣质（＞0.01%）Table 11 Main tannins in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(＞0.01%)(,n=3)

表12 张氏消肿定痛膏渗透液中其他主要物质（前20种）Table 12 Main other substances in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表12 张氏消肿定痛膏渗透液中其他主要物质（前20种）Table 12 Main other substances in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

4 讨论

张氏消肿定痛膏是张氏正骨学术流派传承人在中医理论及张氏正骨学术思想指导下研制而成，由骨碎补、当归、红花、川芎、续断、龙血竭、王不留行、栀子、大黄等25味中药制成，在岳阳市中医医院及张氏正骨学术流派工作室临床工作中，历经20余年数万例的临床验证，具有行气、活血化瘀、消肿止痛的功效，对损伤软组织无菌性炎症的改变、局部急性炎症的修复具有重要促进作用[1-4]。

本研究结果显示，张氏消肿定痛膏中总共检测到542种化合物，其中黄酮类化合物和酚酸最多，分别为122 种和77 种。张氏消肿定痛膏渗透液中检测到422 种化合物，其中最多的是酚酸71 种，黄酮类化合物75 种，萜类37 种；相对质量分数最高的依次为酚酸[（37.83±9.23）%]、氨基酸及衍生物[（9.99±1.20）%]、有机酸[（7.91±2.22）%]。可见酚酸类物质透皮吸收良好，酚酸具有重要的抗炎[5]和治疗神经肌肉相关疾病[6]作用，与张氏消肿定痛膏适应证较一致。

张氏消肿定痛膏渗透液中化合物相对质量分数超过1.00%的分别为绿原酸*、十六烷基鞘胺醇、L-精氨酸、N6-琥珀酰腺苷、脯氨酸甜菜碱、羟基红花黄色素A*、N-乙酰-L-谷氨酸、黄嘌呤、大黄酸-8-O-（6′-O-乙酰基）-葡萄糖、哌啶酸、D-（+）-蔗糖、邻苯二甲酸二丁酯*、新绿原酸*、3，4-二羟基苯甲醛、6-羟基山柰酚-3，6-O-二葡萄糖苷-7-O-葡萄糖醛酸、氨基丙二酸、4-胍基丁酸、异戊烯基腺苷-7-葡糖苷、2-羟基-3-丁烯基硫苷和去甲麻黄碱，其中绿原酸的质量分数最高，它具有抗炎[7-8]、抗氧化[9]等活性作用。透皮吸收化合物主要来源于续断[10-11]、红花[12-13]、大黄[14-15]、川芎[16-17]、枳实[18]和骨碎补[19]等中药材，与张氏消肿定痛膏处方较一致。

本文结果表明，基于UPLC-MS/MS和自建数据库等广泛靶向代谢组研究平台对于复杂的中药复方物质基础研究具有简便、高效的特点，但因仪器分辨率限制，定性分析准确性存在一定争议；另外，由于不同化合物在质谱中响应存在差异，导致使用峰面积进行相对定量分析具有一定误差。但本研究对张氏消肿定痛膏透皮吸收化合物具有初步筛选的作用，对后续提高制剂疗效和质量控制具有一定的指导意义。