茶色素在高镁条件下对离体蟾蜍心脏的保护作用❋

贾梦雪， 王嘉维， 贺 新， 李其发， 张冬梅， 孙艺平， 刘克敏， 傅 雷

(大连医科大学基础医学院，辽宁 大连 116044)

茶色素(tea pigment，TP)有“绿色黄金”之称，是茶叶中茶多酚经过氧化聚合反应衍生出的一种聚合物，具有天然、低毒和高特效性等优点，可对抗心脑血管疾病七大危险因子(年龄超过45岁男性，55岁以上女性或停经者；有心脏病或中风或猝死病家族史；高血压；高血脂；糖尿病；吸烟；肥胖或少运动)。因茶色素与茶多酚的化学结构有高度同源性，故其具有同茶多酚一样的增强免疫力、抗菌、抗病毒和抗氧化等多种药理功能，且基本无毒副作用[1]。镁是人体中重要的宏量元素之一，在正常人体内含量在阳离子中排第四位，仅次于钙、钠、钾。其中约95%左右的镁分布在细胞内，其含量仅次于钾。镁离子浓度是否稳定与机体正常的生理代谢过程密切相关。高镁血症(血清镁浓度>1.2 mmol/L)可对神经-肌肉、中枢神经系统、平滑肌等产生影响，同时高镁还常会引起低钙和高钾，影响机体的电解质平衡[2]，进而对心肌细胞产生一定的损伤作用。本实验室前期相关研究结果显示，TP在钙、钾离子浓度异常时对离体蟾蜍心脏具有一定保护作用[3，4]，但对镁离子异常时的影响结果未见文献报道。本实验旨在探寻TP在高镁浓度异常条件下对离体蟾蜍心脏的保护作用，为保障临床合理性用药提供安全指标。本研究已通过大连医科大学动物委员会、实验动物伦理委员会批准，批准号为AEE21026。

1 材料与方法

1.1 动物

72只中华蟾蜍雌雄兼有，体质量(90±10) g，由大连医科大学实验动物中心提供，实验动物许可证号SCXK(辽)2018-0002，选择北方的秋季开始实验。

1.2 药物及制备

依照标准配方配制任氏液试剂，MgCl2、CaCl2、NaCl等均为优质纯试剂，在1 mL蒸馏水中溶入10 mg TP(检测TP 纯度以游离儿茶素计36.27%，批号20150920，江西绿色制药有限公司)粉末制成10 mg·mL-1茶色素溶液。

1.3 仪器

BL-420S生物机能实验系统和50 g TP-100张力换能器由成都泰盟科技有限公司生产。

1.4 方法

1.5 动物分组及制备

将72只实验动物随机分为对照组和实验组。对照组包括正常任氏液组(A组)、高镁组(B组)和TP组(C组)。A组的离体蟾蜍心脏标本只灌流正常任氏液，B组根据改灌流MgCl2剂量不同分为A+B1组和A+B2组，即离体蟾蜍心脏标本中需要先灌流正常任氏液，然后再分别改灌流含4 mg·mL-1或8 mg·mL-1的MgCl2任氏液。C组根据灌流TP剂量的不同分为A+C1组和A+C2组，即离体蟾蜍心脏标本中需要先灌流正常任氏液，然后再分别改灌流含200 μg·mL-1和400 μg·mL-1的TP任氏液；实验组包括 B1+C1组、B1+C2组、B2+C1组和B2+C2组，如4 mg·mL-1高镁任氏液 + 200 μg·mL-1TP组(B1+C1组)是在离体蟾蜍心脏标本中灌流4 mg·mL-1MgCl2任氏液后，改灌流200 μg·mL-1TP任氏液,其余各组与此进行类似操作，每组8只。

1.5.1 模型制备 根据参考文献制备离体蟾蜍心脏标本，取1只蟾蜍捣毁脑和脊髓，仰卧位固定于蛙板上，打开心腔暴露心脏。在主动脉干下穿2根线，在主动脉球上端剪口，将盛满任氏液的玻璃蛙心插管插向心室，一根线用于插管结扎固定，另一根线远离蟾蜍静脉窦结扎其余的动静脉[5]。将心脏及静脉窦一起剪下，观察到蛙心插管内血液随着心脏的收缩而上下波动明显后，用任氏液冲洗4～6次，最后在心室收缩末期固定蛙心插管内的任氏液为1.0 mL。

1.5.2 检测指标 依据参考文献采用计算机和BL-420 S生物机能实验系统记录离体蟾蜍心脏标本的心肌收缩曲线和心率[6]。同时依照史为清等[7]方法将两电极分别置于离体蟾蜍心房和心室肌来记录40 min内的心电图变化。

1.5.3 给药方法 采用蟾蜍心室外加药的方法，通过心室的收缩波动使心室吸收药物。每次加入一定量溶液前都需要先取出等量的灌流液，从而保证心室外容积的固定，加入不同剂量的MgCl2或TP溶液后需要记录30～40 min内的心搏曲线。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 TP在正常任氏液条件下对离体蟾蜍心脏的心肌收缩力和心率的影响

表1示，在相对适宜条件下，正常任氏液组的离体蟾蜍心脏标本2 h内心肌收缩力和心率均无明显变化。待正常任氏液离体蟾蜍心脏标本稳定后，改灌流200 μg· mL-1TP溶液，换液前后的心肌收缩力和心率均没有明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)。在正常任氏液条件下，当心室外的TP剂量为400 μg·mL-1时，离体蟾蜍心脏标本的心肌收缩力增强，差异有统计学意义(P<0.05)，而心率无变化且差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 TP在正常任氏液条件下对离体蟾蜍心肌收缩力与心率影响比较

2.2 高镁在正常任氏液条件下对离体蟾蜍心肌收缩力和心率的影响

表2示，待正常任氏液蟾蜍心脏标本稳定后，分别改灌流4 mg·mL-1和8 mg·mL-1MgCl2溶液，换液前后蟾蜍心脏标本的心肌收缩力均减弱，心率均减慢，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

2.3 TP在高镁任氏液条件下对离体蟾蜍心脏心肌收缩力和心率的影响

表2示，待高镁任氏液蟾蜍心脏标本稳定后，分别改灌流200 μg·mL-1和400 μg·mL-1的TP溶液，与4 mg·mL-1MgCl2任氏液组比较，高镁TP组的心肌收缩力和心率均增高，差异有统计学意义(P<0.05)。且TP剂量越大，心肌收缩力相对于4 mg·mL-1MgCl2任氏液组增大越多，但心率随TP剂量增大稍减小，但仍高于4 mg·mL-1MgCl2任氏液组心率。与8 mg·mL-1MgCl2任氏液组比较，高镁TP任氏液组心肌收缩力和心率均增高，差异有统计学意义(P<0.01)。且随TP剂量的增大而增高，但仍低于正常任氏液组。

表2 高镁任氏液条件下各组离体蟾蜍心脏心肌收缩力与心率比较

2.4 心电图结果

图1示，离体蟾蜍心电图曲线在高镁任氏液条件下与正常任氏液条件下比较可以看到明显的P-R间期延长，QRS波群变小、增宽。在高镁任氏液中加入TP后，心电图曲线恢复到近似正常任氏液组水平。不同剂量高镁和TP对离体蟾蜍心脏的心电图结果无明显影响。

图1 3种条件下离体蟾蜍心脏的心电图曲线

3 讨论

早期研究表明，TP具备调节血脂、抗氧化和抗多种心脑血管疾病等多种药理作用。主要是因为TP对心血管系统细胞有强有力的保护和修复作用,并具有调节人体免疫力、抗菌抗病毒等多种药理活性,同时也在各种相关疾病的控制和预防中有一定疗效[8]。通过此次实验结果可发现，在高镁条件下，离体蟾蜍的心脏功能可以发生明显下降，但是当改灌流不同剂量的TP后，离体蟾蜍的心脏功能可见不同程度恢复，这种现象说明较低剂量的TP对高镁已经出现了一定的治疗作用，但是剂量尚不足以使其完全恢复正常；而高剂量TP就出现了明显治疗作用，可使离体蟾蜍心脏功能基本恢复正常。

镁离子是机体中一种必不可少的阳离子,对机体内许多阳离子通道有重要调节作用。高镁使离体蟾蜍心肌收缩力显著降低的机制，可能是Mg2+通过对Ca2+的天然拮抗作用,抑制电压依赖性钙通道的开放[9],通过增强Mg2+-Na+交换抑制Ca2+-Na+交换,从而减少Ca2+的跨膜内流,还增强了细胞膜和肌浆网上钙泵的活性,进一步促进Ca2+的排出和摄取[10]。除此之外，Mg2+是300多种酶的辅助因子，Mg2+可通过兴奋心肌细胞线粒体的氧化磷酸化，影响细胞膜Na+-K+-ATP酶和心肌环化腺苷酶的激活等途径，扰乱心肌的正常功能[11]。当细胞外Mg2+增加时，可使静息电位升高，动作电位上升速度变快，幅度加大，时程延长，使心肌细胞兴奋性和自律性降低，表现为自律性细胞的抑制，出现窦性心动过缓以及各种情况的传导阻滞。故而心电图结果显示，P-R间期延长，QRS波群变小增宽。而高血镁症常伴有高钾血症，故可见高尖的T波[2]。加入茶色素后，离体蟾蜍心脏的心肌收缩力、心率以及心电图曲线均有所恢复。汪洋[12]、董帅[13]等相关实验表明，TP可通过降低心肌细胞对K+的通透性以及增强Ca2+的通透性，以减轻高镁对心肌细胞的损伤作用，使心肌膜电位趋于正常，心肌收缩力逐渐恢复，进而起到保护离体蟾蜍心脏功能的作用。同时仍有研究表明，TP的抗氧化和抗自由基产生作用对心肌细胞也具有保护作用[14]。上述结论与本实验结果相符合，因此推测TP在高镁条件下的心肌保护作用可能也与钙、钾离子通道等有关。本次实验研究仅观察到TP高镁条件下对离体蟾蜍的心脏保护作用，其更微观细致的作用机制尚有待进一步的研究。

高镁血症除少数医源性因素导致体内镁含量过多外，大多数是因为肾脏的排泄功能障碍引起。因早期临床表现缺乏特异性容易被忽视，到后期再进行治疗就会更加困难，从而导致预后不良。由本次实验的研究结果推断，利用TP治疗高镁血症可能会显著降低Mg2+对心肌细胞的损伤作用，增强心肌的抵抗力。因TP具有明显的心肌保护作用，预计可以明显改善高镁血症患者的治疗效果以及临床预后。