乳酸对玉米醇溶蛋白基面团品质提升的作用

刘 昊，顾丰颖，朱金锦，杨婷婷，邵之晓，张巧真，王 锋

（中国农业科学院农产品加工研究所，农业农村部农产品加工综合性重点实验室，北京 100193）

乳糜泻易感人群约占世界总人口的1%[1]，终身严格遵守无麸质饮食，是避免因摄入麸质而引起的肠道不适，改善乳糜泻患者生活质量的重要治疗手段。玉米醇溶蛋白约占玉米总蛋白质的50%[2]，作为玉米淀粉工业副产物，玉米醇溶蛋白已被美国食品药品监督管理局批准可以食用[3]。玉米醇溶蛋白能够依靠分子间表面疏水作用，相互联结成网，在面团中起到类似面筋蛋白的功能作用[4]，在无麸质谷物食品开发领域受到关注。但相比小麦面筋蛋白，玉米醇溶蛋白在常温条件下（约20 ℃）功能性表现较差，制得面团的加工品质不尽人意，一定程度上制约了玉米醇溶蛋白基无麸质产品的开发。已有研究表明，向玉米醇溶蛋白体系中添加有机酸，可促进玉米醇溶蛋白结构舒展，彼此聚合连结，形成蛋白网络骨架结构，赋予玉米醇溶蛋白良好的加工性能[5]。Sly等[6]研究了40 ℃以上时，添加少量乳酸-乙酸对玉米醇溶蛋白基面团流变特性及蛋白质构象的影响。但常温条件下（约25 ℃），乳酸调控玉米醇溶蛋白基面团加工性能的相关研究较少。一般谷物面团发酵时也会富集乳酸[7]，有助于改善面团的质构，增加制品风味[8]。相比醒发酸面团制备谷物食品，直接添加有机酸调节面团，无需严格控制醒发条件，免除长时间的恒温处理，简化了生产加工过程[9]。

富含谷氨酰胺的蛋白质会在酸环境中发生脱酰胺反应，使谷氨酰胺的酰胺侧链被转化为带负电荷的羧酸基团，将疏水性的谷氨酰胺反应为中性的谷氨酸。脱酰胺反应，不仅使蛋白质序列发生变化，还会影响到蛋白质的亲疏水性、二级结构、相对分子质量[10-11]。在小麦面筋蛋白的有机酸脱酰胺反应的研究中发现，脱酰胺反应使蛋白质结构趋于舒展，增加了H＋与肽键接触机率，蛋白质变得更易水解[12]。玉米醇溶蛋白中有超过20%的氨基酸是谷氨酰胺，脱酰胺反应底物充足[13]。

面条作为传统的谷物食品，历史悠久，制作方便，是最受东亚居民喜爱的主食之一。在西方人的日常生活中，面条是仅次于面包的谷物食品[14]。目前，玉米醇溶蛋白基无麸质谷物食品的研究品类主要是烘培类食品，有关面条的研究较少。仅检索到Jeong等[15]研究了玉米醇溶蛋白添加量对玉米醇溶蛋白-米粉面条的影响；Kim等[16]研究了米粉粒径对玉米醇溶蛋白-米粉面条的影响。但他们的玉米醇溶蛋白基面条制备环境均在40 ℃，操作条件要求高，且未涉及面条的煮制品质，仅探讨了不同配方下面条的成型情况。

本实验通过调节面团中乳酸和原料粉的比例L/F（mL/g），改善玉米醇溶蛋白基无麸质面团（简称Z面团）的粉质质量。探讨乳酸对Z面团中玉米醇溶蛋白的脱酰胺反应、分子质量、蛋白质表面疏水性、分子结构的影响。基于乳酸对Z面团粉质性能，以及对面团中玉米醇溶蛋白的影响，将Z面团制为面条（简称Z面条），讨论乳酸含量对玉米醇溶蛋白基无麸质面条蒸煮品质的调控效果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳酸（分析纯） 上海麦克林生化科技有限公司；玉米醇溶蛋白 西格玛里奥德里奇公司；沙蒿胶上海源叶生物科技有限公司；玉米淀粉（直链淀粉（24.49±1.41）%，支链淀粉（75.87±1.90）%） 黑龙江鹏程生化有限公司；实验用水均为蒸馏水。

1.2 仪器与设备

DZ2000电子天平 常熟市嘉衡天平仪器有限公司；DN2000杜马斯定氮仪 北京诺德泰科仪器仪表有限公司；Mixolab-2混合实验仪 法国肖邦技术公司；H/16MM台式高速离心机 湖南赫西仪器装备有限公司；DN2000杜马斯定氮仪 北京诺德泰科仪器仪表有限公司；Tensor 27傅里叶变换红外光谱仪 德国布鲁克公司；FD-1C-80真空冷冻干燥机 上海市比郎仪器制造有限公司；A560分光光度计 翱艺仪器有限公司；Mini-Protein Tetra System凝胶电泳系统、ChemiDoc MP凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 原料粉制备

将玉米醇溶蛋白、沙蒿胶和玉米淀粉按10∶1∶39（g/g）的比例充分混合，作为制备Z面团所用原料粉。仅将沙蒿胶和玉米淀粉按1∶39（g/g）的比例充分混合，作为无玉米醇溶蛋白面团（简称NZ面团）所用原料粉。

1.3.2 粉质性能分析

基于混合实验仪的Chopin S标准协议进行粉质实验，设定混合实验仪搅拌刀片转速80 r/min，揉混温度25 ℃。将混合好的原料粉置于混合实验仪中，加入乳酸水溶液，通过控制补加水量，使揉混最大扭矩达（1.1±0.05） N·m（相当于Brabender粉质仪500 BU）。制得面团中L/F分别为0∶50、1∶50、2∶50、3∶50、4∶50、5∶50（mL/g），分别记为Z0、Z1、Z2、Z3、Z4、Z5；NZ0、NZ1、NZ2、NZ3、NZ4、NZ5。面团中水分含量统一为52%。实验重复3 次。

1.3.3 面团中玉米醇溶蛋白的提取

参考张玮等[17]的方法。将Z面团冻干，研磨成粉。向粉末中加入蒸馏水制得悬浊液，磁力搅拌5 h，将分散液离心取沉淀，去除面团中的乳酸。向沉淀固形物中加入70%的乙醇溶液，磁力搅拌5 h，离心吸取上清液，35 ℃下烘干，得到玉米醇溶蛋白。

1.3.4 玉米醇溶蛋白脱酰胺度检测

在酸性条件下，玉米醇溶蛋白与酸发生脱酰胺反应，谷氨酰胺的侧链基团—NH2被替换为—OH，N含量下降[18]。借鉴李传雯等[19]的方法，通过测定蛋白质N含量的变化计算脱酰胺度。将Z面团研磨成粉，用杜马斯定氮仪确定N含量。设N0为玉米醇溶蛋白中N含量，N1为脱酰胺反应后玉米醇溶蛋白中N含量，按式（1）计算脱酰胺度[20]：

1.3.5 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）

参考Li Ting等[21]的方法。通过SDS-PAGE表征玉米醇溶蛋白。将玉米醇溶蛋白分散于Tris-HCl溶液中，加入甘油和SDS充分搅拌，蛋白质上样量10 μg。以Precision Plus Protein Dual Xtra标准品用作分子质量Marker，设定电泳仪电压为260 V，电流13 mA。用固定溶液（40%甲醇，10%乙酸和50%水）固定条带，考马斯亮蓝G-250染色过夜。10%乙酸溶液对凝胶进行脱色，并用凝胶成像系统成像。

用Quantity One按蛋白质条带灰度进行定量分析。分别以提取自Z面团的玉米醇溶蛋白二倍体条带、单倍体条带，以及条带总灰度为C1，以玉米醇溶蛋白的二倍体条带、单倍体条带，以及条带总灰度为空白对照（C0），按式（2）计算面团中玉米醇溶蛋白各条带灰度变化程度：

1.3.6 玉米醇溶蛋白表面疏水性检测

以溴酚蓝的结合量反映蛋白质表面疏水性，适用于醇溶性蛋白表面疏水性检测[22]，参考Smith等[23]的方法。将面团中提取所得玉米醇溶蛋白加入到20 mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH 6.0）中，蛋白质质量浓度5 mg/mL，振荡30 min。加入200 μL的1 mg/mL溴酚蓝去离子水溶液，磁力搅拌10 min。将样品液以4 000 r/min离心15 min，吸取上清液，用磷酸盐缓冲液10 倍稀释，充分振荡。用分光光度计在波长595 nm处测定吸光度A1。以磷酸盐缓冲液稀释10 倍的1 mg/mL溴酚蓝去离子水溶液吸光度A0为检测空白。按式（3）计算1 mg玉米醇溶蛋白的溴酚蓝结合量：

1.3.7 玉米醇溶蛋白二级结构检测

根据Taylor等[24]的方法，用傅里叶变换红外光谱检测不同乳酸含量的Z面团中玉米醇溶蛋白二级结构组成。将新鲜制备的面团进行真空冷冻干燥，研磨为粉状，取2 mg与溴化钾混合研磨。傅里叶变换红外光谱仪设定为衰减全反射模式，扫描64 次，带宽8 cm－1，间隔1 cm－1，波数400～4 000 cm－1。各乳酸含量的混合面团至少重复检测4 次。傅里叶变换红外光谱用Lorentzian滤光器进行傅里叶反卷积，带宽为12，分辨率增强因子为2。

1.3.8 玉米醇溶蛋白基面条制备

按1.3.2节制备Z面团，并擀压为1 mm厚的大张面片，用压面机的面条成型模块，将大张面片切为厚1 mm、宽约3 mm的面条。Z面条中L/F分别为0∶50、1∶50、2∶50、3∶50、4∶50、5∶50（mL/g），分别记为Z0面条、Z1面条、Z2面条、Z3面条、Z4面条、Z5面条。

1.3.9 面条断条率计算

参照LS/T 3304—2017《中国好粮油 挂面》进行。将制备好的面条统一剪至20 cm长，取30 根。于500 mL 100 ℃蒸馏水中，按Sirichokworrakit等[25]的方法确定面条最佳煮制时间。煮熟后捞出，长度不小于12 cm的面条为完整面条，记为N1。实验重复5 次。按式（4）计算面条断条率：

1.3.10 面条蒸煮损失测定

参照LS/T 3304—2017《中国好粮油 挂面》，略作改动。取（10±0.1）g面条（W0），放入500 mL 100 ℃蒸馏水中煮至最佳时间后，轻轻捞出，将面汤倒入量筒，加蒸馏水至500 mL，转入烧杯，混匀。吸取20 mL，置于25 mL恒质量烧杯（M0）中。将烧杯放在105 ℃烘箱中去除面汤水分，测得烘干后烧杯质量（M1）。该实验重复3 次，每次2 个平行。按式（5）计算蒸煮损失率：

1.3.11 面条质构特性测定

参照Liu Rui等[26]的方法测定。面条煮至最佳时间，轻轻捞出，置于蒸馏水（室温）中30 s左右。取5 根面条，同向无间隙放于检测平台。探头A/LKB-F；检测模式TPA；测定前速率2 mm/s；测定时速率0.8 mm/s；测定后速率2 mm/s；压缩比70%；探头2 次下压间隔5 s；起点感应力5 g。Z面团均重复制备2 次，制得Z面条平行煮制3 次，检测3 次。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 面团粉质性能

谷物粉在加水揉混过程中，根据Mixolab搅拌刀片扭矩绘制出的粉质曲线，能够反映面团的加工性能[27]。

从表1可以看出，随Z面团中乳酸添加比例的增加，表征粉质性能的多项指标变化趋势呈先上升后下降，峰值多集中在Z2，说明Z2耐揉混性好，筋力较强，加工性能优越。吸水率决定了谷物产品加工的经济性。Z2吸水率最大，面团吸水能力最强，分别是Z0和Z5的1.13 倍和1.18 倍。面团形成时间反映了蛋白质网络构建速度，Z0～Z5的形成时间呈先延长后缩短趋势，Z2形成时间较长，为195.40 s，显著高于Z0和Z5的116.83、165.00 s（P＜0.05）。面团稳定时间越长，说明面团筋力越强[28]，GB/T 17892—1999《优质小麦 强筋小麦》中规定面团稳定时间大于10 min为一等优质强筋小麦粉。Z2稳定时间最长，达823.20 s（合13.72 min），显著高于其他Z面团（P＜0.05）。弱化度是面团最大扭矩与继续揉混12 min后扭矩的差值，弱化度越小，面团筋力越好，耐揉混性越强[29]。Z1～Z5弱化度均小于Z0，其中Z2的弱化度仅为0.02 Nm，是Z0的1/22，表明添加适量的乳酸可有效提高玉米醇溶蛋白基面团的耐揉混性。粉质质量指数是对面团粉质性能的综合评价指标，Z1～Z5的粉质质量指数均高于Z0，呈先上升后下降趋势，Z2粉质质量指数最高，达1 024.25，分别是Z0的1.73 倍、Z5的1.56 倍。表明添加乳酸可以改善Z面团的粉质性能，当面团中L/F为2∶50（mL/g）时，粉质性能表现最佳。

表1 样品粉质性能参数Table 1 Farinographic properties of doughs Z0-Z5 and NZ0-NZ5

NZ面团的吸水率随乳酸含量增加而小幅度上升，NZ5的吸水率较NZ0约高8%，是淀粉在酸的作用下受到损伤，比表面积增大，水结合位点增多的结果[30]。NZ面团吸水率均低于同等L/F的Z面团，说明玉米醇溶蛋白提高了面团对水分的持留能力。当L/F一定时，Z面团的稳定时间更长，粉质质量指数更高，表明面团中的玉米醇溶蛋白发挥了重要作用，增加了面团的揉混稳定性，提升了粉质性能。此外，Z0、Z1的弱化度分别为NZ0、NZ1的3.67 倍和1.64 倍，耐揉混性更差，但Z2～Z5的弱化度则远小于NZ2～NZ5，表明乳酸含量需达到一定水平才能起到增强玉米醇溶蛋白基面团耐揉混性的效果。

2.2 面团中玉米醇溶蛋白的脱酰胺度

玉米醇溶蛋白中超过20%的氨基酸是谷氨酰胺[13]。有机酸对蛋白质具有很好的脱酰胺作用[31]。脱酰胺反应能够将蛋白质中疏水性的谷氨酰胺转化为中性的谷氨酸[32]，使蛋白质一级序列发生变化，影响到亲疏水性、分子质量、蛋白质构象等[33]，进而改变玉米醇溶蛋白分子间相互作用水平，影响面团中玉米醇溶蛋白网络的构建，宏观上表现为玉米醇溶蛋白基面团的粉质性能变化。

从图1可知，随面团中乳酸添加量的增加，玉米醇溶蛋白的脱酰胺度逐渐提高，Z5中玉米醇溶蛋白的最高，达42.64%。可见乳酸含量与面团中玉米醇溶蛋白的脱酰胺度正相关（Pearson相关性0.994）。在柠檬酸对小麦醇溶蛋白的脱酰胺反应研究中，同样发现体系中柠檬酸溶液浓度越高，蛋白质的脱酰度越大[34]。结合粉质性能结果，得出玉米醇溶蛋白基面团粉质性能的提高与蛋白质脱酰胺度的变化不存在直接关系，需综合考虑在脱酰胺影响下玉米醇溶蛋白的亲疏水性、分子质量、蛋白质二级结构等的变化。

图1 不同样品中玉米醇溶蛋白脱酰胺度Fig.1 Deamidation degrees of zein in doughs Z0-Z5

2.3 面团中玉米醇溶蛋白的分子质量

在小麦面筋蛋白的研究中发现，脱酰胺反应将蛋白质中性的酰胺基团反应为带负电的羧酸基团，蛋白质内氢键减少，表面电负性增加，蛋白质结构趋于舒展，H＋与肽键接触机率增加，蛋白质更易水解，造成分子质量下降[34]。根据图2可知，本研究所用蛋白质主要为α-玉米醇溶蛋白，由35～48 kDa的α-玉米醇溶蛋白二倍体和19、22 kDa的α-玉米醇溶蛋白单倍体组成[35-36]。

由图2可知，提取自Z0的玉米醇溶蛋白与原料玉米醇溶蛋白的条带分布及灰度情况无明显差异，说明当体系中不含乳酸时，面团的揉混过程及从面团中提取玉米醇溶蛋白的操作，均不会对玉米醇溶蛋白分子质量分布情况造成显著影响。添加乳酸后，面团中部分玉米醇溶蛋白发生水解，条带总灰度随面团中乳酸添加量的增加而下降，但未形成新的独立条带。推测是因为在乳酸作用下，玉米醇溶蛋白水解时的肽键断裂位点不一，蛋白质片段间的分子质量差异较大，零散分布于泳道。

图2 不同样品中玉米醇溶蛋白SDS-PAGE条带Fig.2 SDS-PAGE profiles of zein in doughs Z0-Z5

Z1～Z5中部分玉米醇溶蛋白发生水解，少量的二倍体α-玉米醇溶蛋白被水解为单倍体。如图3所示，Z1～Z5的条带总灰度和二倍体条带灰度下降，而单倍体条带灰度呈先上升后下降趋势，Z2中玉米醇溶蛋白单倍体条带灰度最高，推测在揉混过程中，适量乳酸促使玉米醇溶蛋白中二倍体分解形成单倍体；同时，部分玉米醇溶蛋白肽键发生断裂，蛋白质片段化，条带的总灰度有所下降。

图3 不同样品中玉米醇溶蛋白SDS-PAGE条带灰度变化Fig.3 Grayscale change in SDS-PAGE bands of zein in doughs Z0-Z5

2.4 面团中玉米醇溶蛋白的表面疏水性

表面疏水性反映了疏水基团在蛋白质表面的分布情况，是蛋白质的重要特征[37]。玉米醇溶蛋白可以基于表面疏水性彼此联结，构建玉米醇溶蛋白网络结构[35]，充当面团的蛋白质骨架。

溴酚蓝结合量越大，说明蛋白质与溴酚蓝疏水相互作用能力越强，表面疏水性越大。如图4所示，Z1～Z5中玉米醇溶蛋白的表面疏水性均显著高于Z0（P＜0.05），随Z面团中乳酸添加量的增加，玉米醇溶蛋白表面疏水性先上升后下降，其中Z2中玉米醇溶蛋白的表面疏水性最强，溴酚蓝结合量分别为Z0和Z5的5.29 倍和1.31 倍。说明适量的乳酸可促使蛋白质展开，暴露出包藏于蛋白质内部的疏水性基团，提高表面疏水性[38]，但随乳酸含量持续增加，玉米醇溶蛋白表面疏水性发生下降。推测一方面是因为表面疏水性的提高，利于玉米醇溶蛋白分子间发生聚集，导致蛋白质表面能够与溴酚蓝结合的疏水基团数量下降[34]；另一方面，脱酰胺反应使部分谷氨酰胺残基的疏水性侧链基团转化为羧基基团，减少了玉米醇溶蛋白与溴酚蓝结合的疏水性位点。

图4 不同样品中玉米醇溶蛋白的溴酚蓝结合量Fig.4 Amounts of bromophenol blue bound to zein in doughs Z0-Z5

2.5 面团中玉米醇溶蛋白的二级结构

氨基酸组成、外界环境等因素决定了谷物蛋白质的二级结构，影响了蛋白质在面团中的功能表现。就小麦面团来说，β-折叠结构是构建面筋蛋白网络的关键，对面团质构影响显著[39]。研究认为，玉米醇溶蛋白的黏弹性质与β-折叠的形成有关[40]。

适当含量的乳酸可以提高Z面团中玉米醇溶蛋白的β-折叠占比，但乳酸添加过量则会使β-折叠占比下降。如表2所示，随着乳酸添加量的增加，Z面团中玉米醇溶蛋白的β-折叠占比呈先上升后下降趋势，Z2中玉米醇溶蛋白的β-折叠占比最大，分别是Z0和Z5的1.11 倍和1.14 倍；α-螺旋占比无明显变化规律，若将β-折叠和α-螺旋视为高度有序的结构，则占比的变化呈先上升后下降趋势。Mattice等[41]发现经乙酸溶液处理，玉米醇溶蛋白的α-螺旋结构占比下降，分子间β-折叠占比上升。有研究表明，玉米醇溶蛋白中β-折叠占比增加，可使面团结构更为稳定，流变性能提高[42]，改善面团加工性能。Z2良好的粉质性能，可能与Z2中的玉米醇溶蛋白富含β-折叠结构有关。

表2 不同样品中玉米醇溶蛋白二级结构Table 2 Secondary structure composition of zein in doughs Z0-Z5

2.6 面条断条率

断条率是表征面条蒸煮品质的重要指标，断条率较低，则耐煮性好，口感滑爽筋道[43]。如表3所示，随Z面条中乳酸添加量的增加，断条率呈先下降后上升的变化趋势。其中Z2～Z4面条的断条率均低于5%，品质优越，符合LS/T 3304—2017相关要求。说明添加一定量的乳酸可使玉米醇溶蛋白基面条在煮制时更为稳定，不易断条。

表3 不同面条样品蒸煮特性Table 3 Cooking characteristics of noodles Z0-Z5

2.7 面条蒸煮损失

面条在煮制过程中，蒸煮损失率越高，则糊汤现象越严重，面条品质越差。有关小麦面条的研究表明，和面过程中由小麦面筋蛋白构建的网络会对淀粉颗粒形成包裹束缚[44]。在煮制熟化过程中，面条表面的淀粉最先吸水膨胀，若蛋白质网络不够结实稳定，则会有大量的淀粉渗出到汤中，导致蒸煮损失增加，面汤浑浊[45]。如表3所示，随乳酸添加量的增加，Z面条蒸煮损失呈下降后上升的变化趋势，Z2面条的损失最小，分别为Z0面条和Z5面条的68.63%和80.61%。研究发现，蛋白质间的非共价作用影响着面条的质地与强度[46]，牛血清蛋白和小麦面筋蛋白均会通过疏水相互作用强化面条结构，作用效果甚至超过共价键[47]。由2.4节可知，Z2中玉米醇溶蛋白表面疏水性较强，有助于分子间聚集，形成结实连贯的蛋白网络，强化了面条质地，淀粉颗粒被牢牢地包裹，减少了Z2面条在煮制过程中的淀粉渗出。但当乳酸添加量过高时，玉米醇溶蛋白网络软化过度，对淀粉包裹能力下降，使面条蒸煮损失逐渐回升。

2.8 面条的质构特性

TPA质构测试能够客观综合地反映面条的食用品质[44]。测得面条的弹性、回复性、内聚性、硬度、咀嚼性等质构参数与面团的筋道感、弹性呈显著正相关[48]。添加适量的乳酸，可以显著提升Z面团所制面条的质构特性。由表4可知，随着乳酸添加量的增加，Z面条的硬度变化趋势为先下降后上升，而回复性、内聚性、弹性、咀嚼性则呈先上升后下降趋势，且参数峰值集中于Z2、Z3面条。在荞麦面条的研究中发现，面团均匀紧致的微观结构可赋予面条良好的弹性[49]。由此认为不含乳酸时，Z面团中未能形成良好的玉米醇溶蛋白网络，Z0面条的硬度大，弹性差。当面团中L/F分别为2∶50和3∶50（mL/g）时，玉米醇溶蛋白在疏水作用下相互聚集，结成连续稳定的蛋白网络，制得面条质地良好，硬度小，弹性好，口感筋道。但过量的乳酸则会使玉米醇溶蛋白网络弱化，使Z面条质构性能下降。

表4 不同面条样品的质构特性Table 4 Texture profile analysis (TPA) properties of noodles Z0-Z5

3 结 论

通过调节面团中乳酸和原料粉的比例，比较乳酸含量对玉米醇溶蛋白基面团（Z面团）及不含玉米醇溶蛋白的NZ面团粉质性能的影响规律，得出乳酸作用下的玉米醇溶蛋白是影响面团加工品质的关键组分。乳酸会促使面团体系中的玉米醇溶蛋白发生脱酰胺和水解反应，引起蛋白质表面疏水性和二级结构的变化。添加适量的乳酸可以提升Z面团的粉质性能，增加玉米醇溶蛋白表面疏水性，增大β-折叠结构占比，改善Z面条的蒸煮品质。其中L/F为2∶50的玉米醇溶蛋白基面团（Z2）耐揉混性强，弱化度低，粉质表现最佳；测得Z2中玉米醇溶蛋白表面疏水性最强，β-折叠结构占比最高；Z2所制面条断条率低，蒸煮损失小，面条质构适宜。