786例慢性乙型肝炎患者恩替卡韦基因型耐药突变及特征分析

岳秀娟 李庆 王珊珊 陈德喜 石英

近年来，随着核苷(酸)类似物(NA)在临床的广泛应用，一些乙型肝炎患者在得到很好的治疗同时面临着耐药的风险。临床上常用的NA有拉米夫定、替比夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦和替诺福韦等。恩替卡韦和替诺福韦因为耐药屏障高、抗病毒效果强被《慢性乙型肝炎防治指南》[1]推荐为一线用药。本研究主要分析恩替卡韦基因型耐药情况，为临床了解恩替卡韦耐药特点、流行信息及临床合理用药提供参考。

资料与方法

一、标本收集

2009年1月至2020年10月北京佑安医院就诊的恩替卡韦基因型耐药株感染者786例作为研究对象。恩替卡韦基因型耐药株感染者是指HBV POL区 耐药位点rtL180M+rtM204V双阳性(或者仅rtM204I阳性)并且 rtV173、rtT184、rtS202、rtV169和rtV250等5个位点中任一个或一个以上阳性者。为了叙述方便，将rtL180M+rtM204V双阳性和rtM204I阳性者简称为拉米夫定基因型耐药并用LAMr表示，下文中所述rtV173、rtT184、rtS202、rtI 169、rtM 250单位点或多位点突变，均是指在LAMr基础上同时合并上述5种位点之一或一个以上阳性。上述任一耐药突变类型如果合并A181和(或)N236两个位点突变阳性者则被排除。

二、 仪器与试剂

ABI 3500XL DX 遗传分析仪(赛默飞世尔科技有限公司)；核酸提取试剂盒(A36420，中山大学达安基因股份有限公司)，乙型肝炎病毒基因突变检测试剂盒(PCR-测序法)(A15077，广州立菲达安诊断产品技术有限公司)。

三、 HBV DNA 的提取

收集患者空腹静脉血5 mL，离心后取血清。1.5 mL离心管中先后加入蛋白酶K、血清及裂解液，振荡混匀，高速离心10 s， 72℃ 10 min，加入250 μL乙醇，涡旋振荡15 s；将混合液吸至离心柱，高速离心1 min，再分别将500 μL的抑制物去除液和去离子液(2次)加入离心柱，高速离心，14 000×g离心3 min去除残余乙醇；将离心柱放到新的1.5 mL离心管，72℃放置2 min，在离心柱的膜上方加入预热的洗脱液，室温静置后高速离心1 min，所得即为核酸溶液。

四、统计学方法

采用Graphpad Prism 5统计学软件对数据进行处理。计数资料以例数(%)表示，比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、恩替卡韦基因耐药株感染者基本情况

恩替卡韦基因耐药患者786例，男617例，女169例，年龄为(45.7±11.5)岁。其中HBV基因型B亚型79例(10.05%)、C亚型705例(89.69%)、D亚型2例(0.25%)。

二、恩替卡韦基因耐药突变类型

786例恩替卡韦基因耐药株感染者的HBV基因耐药突变类型共计21种，耐药突变类型见表1。

表1 21种恩替卡韦基因耐药突变类型

三、各突变位点单点突变和多点突变情况

按突变位点计算，rtT184位点突变率最高，其次是rtV173位点突变，rtI169位点突变率最低，rtV173位点、rtS202位点及rtT184位点以单位点突变为主要突变形式，rtM250位点单位点突变与联合突变例数相差无几，而rtI169位点以与其他4个位点联合突变为主要突变形式。见表2。

表2 五个突变位点单点和多点突变情况[例(%)]

四、 不同耐药位点在不同性别样本中的变异情况

为了探究耐药位点的突变与性别之间是否有关系，采用Fisher确切概率法对不同位点突变进行了性别间的比较，结果显示，女性患者在rtV173位点更容易发生突变，而男性患者则在rtS202位点更容易发生突变，且差异有统计学意义(P<0.05)。

五、 不同耐药位点在不同年龄组中的变异情况

各位点在不同年龄组的占比各有特点，rtT184位点在≥60岁年龄组占比最高，rtV173在≤30岁年龄组占比最高，rtS202则在30～60岁年龄组占比最高。将各位点在不同年龄组进行统计学分析，结果显示，rtT184位点和rtV173位点在不同年龄组之间的差异有统计学意义(P<0.05)，其他3位点在不同年龄组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。

六、 不同耐药位点在不同HBV基因型中的变异情况

结果显示rtV173、rtS202、rtM250在HBV不同基因亚型中的变异差异有统计学意义，rtV173更容易在C亚型中发生突变，rtS202和rtM250更容易在B亚型中发生突变，见表3。

表3 各位点在B、C亚型间的变异情况[例(%)]

讨 论

NA类药物虽然可以有效抑制病毒复制和改善肝功能，但不能使病毒彻底清除，也很难实现HBsAg血清学转换，这就需要长期甚至终身服用，而长期服药就带来了耐药风险[2-4]。研究表明，HBV耐药首先由基因型耐药引起，进而造成病毒学突破和生化突破，最终导致临床治疗失败。因此,重视基因型耐药突变的监测和分析,可以帮助临床及早发现耐药，及时调整治疗方案[5-6]。

恩替卡韦5年的累积耐药发生率为1.2%；在对拉米夫定耐药的CHB患者中，恩替卡韦治疗5年的累积耐药发生率升至51%。由于恩替卡韦在我国上市之前，已经累积了相当数量的拉米夫定经治患者，因此了解真实世界中恩替卡韦耐药情况及特征，对于临床治疗决策具有重要参考价值[7-9]。

本研究结果显示，786例恩替卡韦基因型耐药患者中rtT184位点突变最常见，而rtI169位点突变少见并且以与其他位点同时突变为主，与刘妍等[4]的研究结果一致。HBV耐药突变与基因型相关，本研究发现rtV173、rtS202、rtM250等3个位点突变与HBV基因型相关，rtV173更容易在C亚型中发生突变，rtS202和rtM250更容易在B亚型中发生突变；而rtT184、rtI169两个位点突变在HBV不同基因型之间的差异无统计学意义。此外，本研究结果显示女性患者在rtV173位点更容易发生突变，而男性患者则在rtS202位点更容易发生突变，而其他位点在男女之间的差异无统计学意义。在不同年龄组的比较中发现rtT184位点在≥60岁年龄患者中更容易突变，而rtV173位点突变则在≤30岁年龄患者中更容易发生，这与以往报道不同[10-14]。

本研究对真实世界中HBV恩替卡韦耐药类型、不同耐药位点在人群中的分布特点及不同耐药位点在HBV不同基因型中的突变情况做了分析和阐述，对于临床深入了解HBV恩替卡韦耐药特点及合理调整用药具有意义。