破格救心汤的溶血性及急性毒性试验研究

莫兰健，黎 莉，赵学青，唐静芝，李 莹，宁 天，李日伦

（广西卫生职业技术学院，广西 南宁 530023）

破格救心汤来源于《伤寒论》中的经方四逆汤[1]。在四逆汤的基础上添加参附龙牡救逆汤和名医张锡纯的来复汤，即为破格救心汤。此方中重用附子回阳，并用山萸肉敛阴、麝香醒窍。四逆汤是传统中医常用的强心类方剂，在治疗心力衰竭等重症方面的效果显著。《神农本草经》中记载，附子有大毒。附子为破格救心汤中的君药。此药的毒性正是其“回阳”的药效所在。在临床上，经静脉注射给药起效的速度最快。本次研究对破格救心汤进行了溶血性试验，以观察将该方制成注射剂使用的安全性。为了验证临床应用破格救心汤的安全性，本次研究中对破格救心汤进行了急性毒性试验。

1 试验材料

昆明种小白鼠200 只，平均体重为（20±2.0）g，雌雄小鼠数量各半，购于广西医科大学实验动物中心，合格证号为SCXK (桂):2009-0802。家兔1 只，购于东郊种兔场。制作破格救心汤的中药材购于广西康全药业连锁有限公司。

2 试验方法

2.1 破格救心汤的体外溶血性试验

制作5 组含附子生药的破格救心汤药液，作为受试药液。A 组药液中附子的含量为0.03 g/mL，煎煮0.5 h。B 组药液中附子的含量为0.1 g/mL，煎煮0.5 h。C 组药液中附子的含量为0.2 g/mL，煎煮0.5 h。D 组药液中附子的含量为0.4 g/mL，煎煮1 h。E 组药液中附子的含量为0.8 g/mL，煎煮2 h。将《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》作为理论指导，取家兔血液制作红细胞悬液，对破格救心汤进行体外溶血性试验。取家兔的静脉血20 mL，用玻璃棒均匀搅拌血液10 min，先去除血液中的纤维蛋白原，制成脱纤血液[2]，再加入10 倍量的生理盐水，摇匀，进行离心处理15 min（离心机的转速为1300 转/min），去除离心管中的上清液。用生理盐水洗涤沉淀的红细胞，洗涤2 ～3 次，直至上清液不再显红色为止。将得到的红细胞加入到生理盐水中配置成2% 的混悬液，备用。取7 支洁净的试管。在各试管中分别加入2% 红细胞混悬液、生理盐水或蒸馏水、受试药液（具体的添加方法见表1）。混匀后，将试管置于温度为（37±0.5）℃的恒温水浴箱中，每隔15 min 观察1 次试管中溶液的情况并记录。1 h后，每隔l h 观察1 次相关情况，连续观察3 h。如果观察到试管中溶液变得透明，表示溶液发生溶血。如果溶液分层，上清液无色、透明，下层溶液混浊，表示溶液未发生溶血。如果在溶液中观察到絮状沉淀物，表示有红细胞凝聚反应。若在3 h 内溶液中不发生溶血或红细胞凝聚反应，可判定该溶液能够供静脉注射用。如果该溶液出现红细胞凝聚反应，可按免疫荧光检测法确定红细胞凝集反应的真实性。如果溶液中的凝集物不能摇散或在玻片上不能被冲散可判定溶液发生真凝集反应，表示该溶液不适合临床静脉注射使用。如果溶液中的凝集物在振荡试管后能均匀分散或在显微镜下观察到溶液中凝集的红细胞被冲散（将凝集物放在载玻片上，在盖玻片边缘加2 滴生理盐水）可判定溶液发生假凝集反应。

2.2 破格救心汤的急性毒性试验

白鼠（雌雄小鼠各半数），随机将其分为对照组、A 组、B 组、C 组、D 组及E 组。使小鼠禁食约14 h 后[4]，为A ～E 组小鼠分别使用附子生药含量为0.03 g/mL、0.1 g/mL、0.2 g/mL、0.4 g/mL、0.8 g/mL 的受试药液按0.4 mL/10 g 的最大给药量进行灌胃给药，每日给药2 次，两次给药间隔的时间至少为8 h。为对照组小鼠使用等量的饮用水灌胃[5]。给药后，将小鼠正常饲养于清洁实验室中，清洁实验室的平均室温为（24±2）℃，室内相对湿度为45% ～60%。观察小鼠的活动、皮毛、采食量、体重、排便等情况有无异常，并观察小鼠有无中毒症状及死亡情况（若小鼠死亡，立即解剖并进行病理学检查），连续观察1 周。1 周后，处死小鼠并进行解剖，肉眼观察其肝、心、脾、肺、肾、膀胱、性腺（子宫、卵巢或睾丸和附睾）、胃、大肠、小肠等，与对照组小鼠进行比较，分析其上述脏器是否出现异常变化。

2.2.1 预试验 取60 只禁食时间在24 h 以上的健康小白鼠（雌雄小鼠各半数），随机将其分为对照组、A 组、B 组、C 组、D 组及E 组[3]。为A ～E组小鼠分别使用附子生药含量为0.03 g/mL、0.1 g/mL、0.2 g/mL、0.4 g/mL、0.8 g/mL 的受试药液，按0.4 mL/10 g 的最大给药量进行灌胃给药。为对照组小鼠使用等量的饮用水灌胃。1 周后，给药组小鼠与对照组小鼠均未死亡，无法按正常规律测定出半致死量，故继续进行最大给药量的测定试验。

2.2.2 最大给药量测定试验 选择120 只健康小

2.3 统计学方法

采用SPSS 23.0 统计软件处理本次研究中的所有数据。计量资料用±s表示，用t检验。计数资料用% 表示，采用χ² 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 对破格救心汤进行体外溶血性试验的结果

将各试管放置3 h，第1 ～第6 支试管进行溶血性试验的结果均呈阴性，第7 支试管进行溶血性试验的结果呈阳性。详见表1。

表1 对破格救心汤进行体外溶血性试验的结果（mL）

3.2 对破格救心汤进行急性毒性试验的结果

用受试药液灌胃后，大多数小鼠的活动量增多。用受试药液灌胃后2 h 内，小鼠的进食量减少，排便排尿无异常，部分小鼠在进食前会先喝水。灌胃后3 h，小鼠的活动、进食量等逐渐恢复正常。此后连续观察7 d，小鼠的活动、皮毛、排便情况均正常。用受试药液灌胃后，除D 组小鼠的进食量在第7 天有明显变化外，其余各组小鼠的进食量与对照组小鼠相比差异无统计学意义（P＞0.05），详见表2。用受试药液灌胃后，各组小鼠的体重与对照组小鼠相比差异无统计学意义（P＞0.05），详见表3。6 组小鼠均未死亡，详见表4。试验结束后，对处死的小鼠进行解剖，其肝、心、脾、肺、肾、膀胱、性腺( 子宫、卵巢或睾丸和附睾)、 胃、大肠、小肠等脏器均未发生明显的异常改变。

表2 用受试药液灌胃前后小鼠进食量的比较（g，± s）

表2 用受试药液灌胃前后小鼠进食量的比较（g，± s）

注：*表示与对照组小鼠相比，P ＜0.05；#表示与对照组小鼠相比，P ＞0.05。

组名给药前给药后第1 天第3 天第5 天第7 天对照组 5.6±0.08 5.3±0.07 5.6±0.09 5.8±0.08 6.3±0.09 A 组 5.3±0.07# 5.1±0.08# 5.3±0.07# 5.7±0.07# 5.9±0.08#B 组 5.5±0.08# 5.2±0.07# 5.5±0.09# 5.9±0.08# 6.0±0.07#C 组 5.2±0.07# 5.0±0.08# 5.2±0.07# 5.4±0.07# 5.9±0.08#D 组 5.7±0.06# 5.5±0.08# 5.7±0.07# 5.9±0.07# 7.5±0.08*E 组 5.2±0.07# 5.0±0.08# 5.2±0.07# 5.7±0.07# 6.0±0.08#

表3 用受试药液灌胃前后小鼠体重的比较（g，± s）

表3 用受试药液灌胃前后小鼠体重的比较（g，± s）

注：# 表示与对照组小鼠相比，P ＞0.05。

组名给药前给药后第一天第三天第五天第七天对照组 19.0±0.82 19.6±1.01 22.8±1.45 25.7±2.10 27.7±2.42 A 组 19.3±0.85# 19.8±0.93# 23.2±1.82# 26.3±1.89# 28.3±2.61#B 组 19.2±0.86# 19.8±1.01# 22.9±1.60# 25.7±2.21# 28.0±2.75#C 组 19.1±0.66# 19.7±0.75# 22.4±1.49# 24.9±2.39# 26.9±3.17#D 组 19.5±0.64# 20.1±0.71# 23.5±1.78# 26.4±2.61# 29.0±3.44#E 组 19.0±0.69# 19.5±0.83# 22.1±1.19# 25.5±1.81# 27.3±2.28#

表4 用受试药液灌胃后小鼠的存活情况（只）

3 讨论

本研究中对破格救心汤进行体外溶血性试验的结果显示，附子生药含量为0.03 g/mL、0.1 g/mL、0.2 g/mL、0.4 g/mL、0.8 g/mL 的破格救心汤制成的注射剂安全性均较高，可供临床静脉注射使用。破格救心汤可用于治疗心力衰竭等急危重症。煎煮中药汤剂费时过长，在用其治疗急症时难免缓不济急，贻误病机。如果能把中药汤剂改为注射剂，对患者进行静脉给药，在临床抢救领域必将取得重大突破。对本研究中表2、表3 的数据进行分析可知，给药组小鼠与对照组小鼠的一般情况相比较，无明显差异。对表4 中的数据进行分析可知，给药组与对照组中均无小鼠死亡。一般认为，按体重计算，小鼠每日最大的给药量相当于成人临床日给药量的100 倍以上是较为安全的[6]。为小鼠每日使用破格救心汤药液的剂量若为16 g/kg，不会使其发生中毒。若进一步增加该药液的用量，小鼠可能会发生毒性反应。在临床上，为了应对患者可能发生的附子中毒情况，中医师要严格把控破格救心汤的用量，并随时准备好解毒药品。

本次研究中，经体外溶血性试验证实，破格救心汤对家兔的血红细胞无体外溶血和凝集反应，将该方制成注射剂使用的安全性较高。经急性毒性试验证实，破格救心汤是较安全的方剂，不会导致小鼠死亡或发生内脏病变。