一测多评法同时测定枇杷叶标准汤剂中3种绿原酸

李文兵， 邢 冷， 卢君蓉， 许 玲， 姜艳娇， 刘 圆， 胡昌江3,*

(1.西南民族大学青藏高原研究院，四川 成都 610041；2.四川省羌彝药用资源保护与利用技术工程实验室，四川 成都 610225；3.国家中医药管理局“中药配方颗粒质量与临床疗效评价”重点研究室，四川 成都 611900；4.四川新绿色药业科技发展有限公司，四川 成都 611900；5.成都中医药大学，四川 成都 611137；6.西南民族大学民族医药研究院，四川 成都 610041)

枇杷叶为蔷薇科植物枇杷Eriobotryajaponica(Thunb.)Lindl.的干燥叶，是中医临床常用的一味中药，具有清肺止咳，降逆止呕之功效，临床上常用于肺热咳嗽、气逆喘急、胃热呕逆、烦热口渴等症的治疗[1]。现代研究表明，枇杷叶有止咳[2]、祛痰[3]、抗炎[4]、抗肿瘤[5]、抗肾衰竭[6]等药理作用，其主要成分为三萜[7-8]、挥发油[9]、倍半萜[10]、黄酮[11]等。

枇杷叶在中医临床上多入汤剂，而2020年版《中国药典》对其质量控制指标为三萜类(齐墩果酸和熊果酸)，由于该类成分极性较小，在汤剂中难以溶出和检测。国家药典委员会公示第一批中药配方颗粒标准中，基于检测成本的考虑，枇杷叶配方颗粒仅以绿原酸单一成分作为质控指标，导致其专属性不强，难以全面控制产品质量。因此，本文以绿原酸为参照物，建立枇杷叶标准汤剂中一测多评方法，同时测定新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸的含量，不仅可以降低检测成本，还能实现多成分同时检测，增加专属性，可为枇杷叶标准汤剂及配方颗粒标准提升和修订提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；Shimadzu LC-20A型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；Waters 2695-2996高效液相色谱仪(美国Waters公司)；XP26型电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；KQ5200DB型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；1810A摩尔原子型超纯水器(上海摩勒科学仪器有限公司)；NCCO-300型全自动切药机(杭州金竺机械有限公司)；全自动分体式陶瓷煎药壶(潮州市永达基电器厂)；LGJ-100F型真空冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司)。

1.2 试剂与药物 绿原酸(批号110753-201415，纯度96.2%，中国食品药品检定研究院)；新绿原酸(批号17062003，纯度98%)、隐绿原酸(批号17061401，纯度98%)对照品(成都普菲德生物技术有限公司)。枇杷叶20批，产地四川简阳(3批)、金堂(4批)、仁寿(8批)、中江(1批)(批号BT01～BT16)，浙江绍兴、丽水(各1批)(批号BT17～BT18)，福建南平(2批)(批号BT19～BT20)，经专家鉴定为正品，按照2020年版《中国药典》规定除去绒毛，用水喷润，切丝，干燥。乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent 5 HC C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相0.4%磷酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～5 min，95%A；5～35 min，95%～78%A；35～50 min，78%A)；体积流量1.0 mL/min；柱温35 ℃；检测波长327 nm；进样量10 μL。在此条件下，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸色谱峰与样品中其他组分色谱峰达到基线分离，理论塔板数均大于5 000，见图1。

1.新绿原酸 2. 绿原酸 3. 隐绿原酸图1 各绿原酸HPLC色谱图

2.2 对照品溶液制备 精密称取绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸对照品适量，置于量瓶中，50%甲醇溶解并稀释至刻度，质量浓度分别为1.077 2、0.581 5、0.348 1 mg/mL，精密量取适量，置于量瓶中，50%甲醇稀释至刻度，即得(含绿原酸0.430 9、0.172 4、0.068 9、0.027 6、0.011 0 mg/mL，新绿原酸0.232 6、0.093 0、0.037 2、0.014 9、0.006 0 mg/mL，隐绿原酸0.139 2、0.055 7、0.022 3、0.008 9、0.003 6 mg/mL)。

2.3 标准汤剂制备 取饮片适量，按枇杷叶标准汤剂工艺制备[12]，即得。

2.4 供试品溶液制备 取标准汤剂粉末约0.2 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入25 mL 50%甲醇，密塞，称定质量，超声(600 W、40 kHz)处理30 min，放冷，50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.5 线性关系考察 精密吸取对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样10 μL测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各绿原酸线性关系

2.6 精密度试验 精密吸取“2.2”项下对照品溶液10 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸峰面积RSD分别为0.08%、0.12%、0.09%，表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验 取同一批本品(批号BT01)6份，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样10 μL测定，测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸含量RSD分别为0.78%、0.89%、1.01%，表明该方法重复性良好。

2.8 稳定性试验 取同一份供试品溶液(批号BT01)适量，于0、1、2、4、8、16、24 h在“2.1”项色谱条件下进样10 μL测定，测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸含量RSD分别为1.24%、1.03%、1.51%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.9 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的标准汤剂(批号BT01)6份，每份0.10 g，加入1 mL对照品溶液(含绿原酸0.404 1 mg/mL、新绿原酸0.352 0 mg/mL、隐绿原酸0.503 2 mg/mL)，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样10 μL测定，计算回收率，结果见表2。

表2 各绿原酸加样回收率试验结果(n=6)

2.10 相对校正因子、相对保留时间测定及耐用性考察

2.10.1 相对校正因子 以绿原酸为内标，采用多点校正法[13-15]计算新绿原酸和隐绿原酸的相对校正因子、相对保留时间，结果见表3。

2.10.2 不同仪器对相对校正因子的影响 考察Agilent 1260、Shimadzu LC-20A、Waters 2695-2996色谱仪对相对校正因子的影响，结果见表4，可知均无明显影响(RSD<3%)。

2.10.3 不同色谱柱对相对校正因子的影响 在Agilent 1260 HPLC色谱仪上，考察Agilent 5 HC、Phenomenex、Diamonsil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)对相对校正因子的影响，结果见表5，可知均无明显影响(RSD<3%)。

表3 各绿原酸相对校正因子、相对保留时间测定结果

表4 不同仪器对相对校正因子的影响(n=3)

表5 不同色谱柱对相对校正因子的影响(n=3)

2.11 样品含量测定 取不同产地、批次标准汤剂冻干粉，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下分别采用外标法、一测多评法测定含量，结果见表6，可知2种方法无明显差异，表明一测多评法具有较高的可信度。

3 讨论

中药标准汤剂是在中医药理论指导下，参考现代提取方法，经标准化工艺制备而成的单味或复方中药水煎剂[16-17]，主要用于中药新型饮片及成方制剂的工艺规范、质量控制及一致性评价等[18]。“标准汤剂”概念最早由日本提出，作为汉方药制剂的化学和生物学基准。国内在1998年魏刚[19]首次提出中药复方的研究应建立在标准汤剂的基础之上，但直到2016年陈士林等[20]系统阐述中药标准汤剂的内涵和外延，才引起相关监管部门的重视，并逐渐成为评价中药配方颗粒及经典名方制剂工艺和质量标准是否合理的基准物质。

表6 各绿原酸含量测定结果(n=2)

2020年版《中国药典》枇杷叶质量控制指标为熊果酸和齐墩果酸，前期对20批次枇杷叶标准汤剂中熊果酸和齐墩果酸含量进行测定，结果发现，标准汤剂中熊果酸和齐墩果酸含量极微，总量仅为0.002%～0.072%；进一步通过UPLC-Q-TOF-MS对枇杷叶标准汤剂中化学成分进行鉴定，并参照文献[21]用标准品比对，确认含有新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸等3种苯丙素类成分，且含量较高。该类成分有抗菌[22]、抗炎[23]等药理作用，与枇杷叶清肺止咳传统功效有一定关联性，因此，选择3种绿原酸类成分作为标准汤剂的含测指标，并建立一测多评含量测定方法，不仅可节约检测成本，还能提高质量控制专属性，可为枇杷叶标准汤剂及配方颗粒标准的修订提供参考。