六味地黄苷糖片多糖部位相对分子质量与组成分析

郝晓娟， 付 娟， 胡军华， 王振中， 肖 伟1，*

(1.南京中医药大学，江苏 南京 210000；2.中药制药过程新技术国家重点实验室，江苏 连云港 222001；3.江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001)

六味地黄方由熟地黄、酒萸肉、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻组成，始见于《小儿药证直诀》，由宋朝名医钱乙首创，是中医滋补肾阴的经典名方[1]。六味地黄苷糖片是在六味地黄汤的基础上，结合现代药理学、药效学活性评价，经两次醇沉、两步层析提取分离，由水溶性多糖、以甘露三糖为主的寡糖，以莫诺苷、马钱苷、芍药苷为主的糖苷类组成的创新中药，其中多糖部位主要表现为免疫促进作用[2]。

多糖是一类由多羟基醛或多羟基酮及其衍生物、聚合物的总称，为中药中主要药效物质基础之一[3]，其分子量大，结构复杂，生物活性有明显差异，近年来越来越受到关注。由于该成分生物活性、分子量与其分布和组成密切相关，故2015年版《中国药典》已将相对分子质量及其分布列入该成分质量标准中[4-5]。

本实验以六味地黄苷糖片中多糖部位为研究对象，对其相对分子质量及组成进行初步考察，不仅为进一步研究该部位生物活性与其一级结构的关系提供基础，又为提升该制剂质量标准提供依据。

1 材料

AL204、MS-105DU电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；HH-8数显恒温水浴锅(金坛市康华电子仪器制造厂)；H1850R台式高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；LC-28AB高效液相色谱仪，配置RID-10A示差折光检测器(日本岛津公司)；KQ-500DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；DZF-6050型真空干燥箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)；HGC-36A型氮吹仪(天津市恒奥科技发展有限公司)；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；Agilent7890B-7698A气相色谱仪(美国安捷伦公司)；磷酸二氢钾为色谱纯，购自上海麦克林生化科技有限公司；三氟乙酸为色谱纯，购自美国天地公司；乙醇、丙酮、乙醚、吡啶、甲醇、硼氢化钠、三氯甲烷等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；正丙胺购自阿拉丁试剂(上海)有限公司。各相对分子质量葡聚糖(T670、T410、T270、T110、T70、T40、T20、T5)购自美国Sigma-Aldrich公司、阿拉丁试剂(上海)有限公司；L-(+)-阿拉伯糖(批号WXBB0 276 V，纯度≥99%)、L-鼠李糖(批号WXBB5 979 V，纯度≥99%)均购自美国Sigma-Aldrich公司；D-无水葡萄糖(批号110833-201908，纯度99.9%)、D-木糖(批号111508-201605，纯度99.9%)、D-甘露糖(批号140651-201805，纯度99.9%)、肌醇(批号190077-201501，纯度99.6%)、半乳糖(批号100226-201807，纯度100%)、D-葡萄糖醛酸(批号140648-201804，纯度99.8%)、D-半乳糖醛酸(批号111646-201702，纯度95.1%)均购自中国食品药品检定研究院。

六味地黄苷糖片多糖部位(批号Z160601、Z171001、Z191001、Z191201、Z191202)，购自江苏康缘药业股份有限公司。

2 方法

2.1 分子量测定

2.1.1 色谱条件与系统适用性试验 TSK-GEL G4000PWXL、TSK-GEL G1000PW色谱柱(7.8 mm×300 mm)串联[6-8]；流动相0.02 mol/L KH2PO4溶液；体积流量0.5 mL/min；RID检测器；检测器、柱温箱温度40 ℃；进样量20 μL。

2.1.2 多糖部位前处理 参考文献[9]报道。取多糖部位适量，60%乙醇洗涤，每次20 mL，涡流2 min后离心，重复以上操作至醇洗液呈无色(约洗涤16次)，转移至布氏漏斗中，分别用乙醇、丙酮、乙醚反复洗涤，挥干，备用。

2.1.3 供试品溶液制备 精密称取“2.1.2”项下醇洗多糖2.5 g，置于烧瓶中，精密加入流动相100 mL，称定质量，100 ℃下回流提取1 h，放冷，加水补足减失的质量，摇匀，14 000 r/min离心5 min，取上清液，即得。

2.1.4 对照品溶液制备 精密称取不同相对分子质量的葡聚糖、D-无水葡萄糖对照品各50 mg，置于10 mL量瓶中，加水溶解后定容至刻度，摇匀，离心，即得。

2.1.5 方法学考察

2.1.5.1 线性关系考察 取“2.1.4”项下对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定。采用GPC软件，以对照品重均分子量的对数(logMw)为纵坐标(Y)，保留时间为横坐标(X)进行回归，得到方程为Y=2.622 4×10-3X3-0.220 8X2+5.811 8X-43.186 6 (R2=0.995 2)，在5 000～670 000 Da范围内线性关系良好。

2.1.5.2 精密度试验 精密吸取“2.1.3”项下供试品溶液20 μL，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定6次，采用GPC软件测得峰面积RSD为0.06%，表明仪器精密度良好。

2.1.5.3 稳定性试验 精密吸取“2.1.3”项下供试品溶液20 μL，于0、3、6、9、12、15、18、21、24 h在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，采用GPC软件测得峰面积RSD为0.49%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.5.4 重复性试验 精密称取多糖部位样品6份，按“2.1.2”项下方法处理，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样20 μL测定，采用GPC软件测得峰面积RSD为0.81%，表明该方法重复性良好。

2.1.6 重均分子量测定 取六味地黄苷糖片多糖部位Z160601、Z171001、Z191001、Z191201、Z191202进行测定，测得重均相对分子质量分别为113 912、146 446、151 939、191 694、177 122。

2.2 多糖组成分析

2.2.1 气相色谱条件 ZB-5色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；氢火焰检测器，进样口温度250 ℃，检测器温度280 ℃；氮气体积流量0.6 mL/min；分流比20∶1；程序升温(200 ℃保持2 min，3 ℃/min升至245 ℃，10 ℃/min升至270 ℃，保持2 min)[10-13]；进样量2 μL。

2.2.2 标准品衍生物制备 精密称取鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、肌醇、甘露糖、无水葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸对照品各2 mg，置于10 mL具塞试管中，加入1 mL水溶解，再加入0.5 mol/L 碳酸钠溶液78 μL，30 ℃下水浴45 min，加入4%硼氢化钠溶液0.5 mL，室温下放置1.5 h，滴加25%乙酸至无气泡产生以除掉过量硼氢化钠，将反应液过阳离子交换树脂柱，并用8 mL水洗脱，洗脱液浓缩至干后加入3 mL甲醇，浓缩至干，重复5次以除净过量乙酸。将浓缩至干的样品于85 ℃下真空干燥2 h，加吡啶、正丙胺各1 mL，55 ℃下水浴30 min，放冷后于55 ℃水浴中氮气吹干，加吡啶、乙酸酐各0.5 mL，95 ℃下水浴1 h，放冷后于25 ℃水浴中氮气吹干，于40 ℃下真空干燥3 h，取无水硫酸钠干燥24 h 的0.3 mL氯仿溶解样品，取10 μL，氯仿稀释至200 μL，即得，并进行GC分析[14-15]。

2.2.3 样品衍生物制备 精密称取样品5 mg，加入0.4 mol/L三氟乙酸3 mL，100 ℃下水浴4 h，加入甲醇3 mL浓缩至干，反复4～5次以除净三氟乙酸，加1 mL水充分溶解，从“加入0.5 mol/L 碳酸钠溶液78 μL”开始，其余操作同“2.2.2”项下，即得。

2.2.4 单糖组成测定 取六味地黄苷糖片多糖部位Z160601、Z171001、Z191001、Z191201、Z191202进行测定，结果见表1。

表1 单糖组成测定结果

3 结果

3.1 相对分子质量测定

3.1.1 流动相选择 取“2.1.3”项下供试品溶液、“2.1.4”项下对照品溶液，分析采用TSK-GEL G4000PWXL(7.8 mm×300 mm)色谱柱；流动相Na2SO4、NaH2PO4、KH2PO4溶液；体积流量0.5 mL/min；RID检测器、柱温箱温度40 ℃，结果见图1。由此可知，Na2SO4溶液洗脱时供试品溶液在保留时间20.5 min附近有1个固定倒峰，可影响葡聚糖出峰，而NaH2PO4、KH2PO4溶液洗脱时不存在倒峰，故选择磷酸盐溶液作为流动相。

图1 各流动相下T40 HPGPC色谱图

3.1.2 供试品提取方式选择 取“2.1.2”项下多糖样品，加流动相涡流2 min，制成每1 mL含25 mg单糖的供试品溶液，离心，取上清液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，结果见图2。由此可知，多糖样品直接涡流后进样时色谱图分离度较差，重均相对分子质量20 000～70 000，可能是因为涡流不能将大分子量的多糖提取完全。

图2 涡流提取多糖分子量HPGPC色谱图

3.1.3 串联色谱柱选择 固定流动相为KH2PO4溶液，检测器、柱温箱温度均为40 ℃，体积流量0.5 mL/min，RID检测器，考察单用TSK-GEL G4000PWXL色谱柱(7.8 mm×300 mm)及串联TSK-GEL G1000PW色谱柱(7.8 mm×300 mm)的分离效果，结果见表2、图3～4。由此可知，单根色谱柱的分离度低于串联色谱柱，不能很好地表明多糖部位的重均相对分子质量，故本实验选择串联色谱柱。

表2 单根色谱柱分子量测定结果

图3 单根色谱柱多糖样品HPGPC色谱图

图4 串联色谱柱多糖样品HPGPC色谱图

3.2 单糖组成分析

3.2.1 多糖部位酸水解种类选择 分别采用硫酸、三氟乙酸对多糖部位进行酸水解并衍生后，采用紫外检测器测定各单糖含量，结果见表3。由此可知，三氟乙酸水解后除半乳糖醛酸含量低于硫酸水解后外，其他单糖的量均更高，而且该试剂腐蚀性小，沸点较低，容易除去，故本实验选择其对多糖部位进行水解。

表3 硫酸、三氟乙酸水解多糖后单糖含量比较

3.2.2 水解条件选择 分别以0.4 mol/L三氟乙酸、2 mol/L三氟乙酸对多糖部位水解2、4、6 h，按“2.2.3”项下方法制备衍生物，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，结果见表4。由此可知，0.4 mol/L三氟乙酸水解4 h、0.4 mol/L三氟乙酸水解6 h、2 mol/L三氟乙酸水解6 h得到的单糖种类相同，综合考虑成本和效率，本实验选择0.4 mol/L三氟乙酸水解4 h。

表4 水解条件考察结果

3.2.3 结果分析 多糖部位经过三氟乙酸水解后采用GC-MS进行分析，并与NIST数据库进行匹配，结合单糖标准品衍生化后比对保留时间，初步鉴定出7种单糖衍生物，色谱图见图5，GC-MS裂解碎片与NIST质谱数据库的对比见图6，由于阿拉伯糖、木糖均为五碳醛糖，甘露糖、葡萄糖、半乳糖均为六碳醛糖，衍生后质谱碎片相似，故在NIST质谱数据库中得到的结构信息也相似。表5、图5显示，多糖水解液在鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡

1.鼠李糖 2.阿拉伯糖 3. 木糖 4. 肌醇 5. 甘露糖 6. 葡萄糖 7. 半乳糖 8.葡萄糖醛酸 9. 半乳糖醛酸图5 各单糖GC色谱图

注：图中央横线上方数字为样品裂解数据，下方数字为数据库裂解数据。图6 各色谱峰GC-MS裂解碎片与NIST质谱数据库比较

萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸7种单糖相同保留时间处均存在对应色谱峰，并且多糖水解液中葡萄糖含量最高。

任凤霞[16]等报道，六味地黄汤中多糖部位由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸组成，而未检测到木糖与甘露糖；本实验发现，多糖水解液中木糖、甘露糖含量较低，表明GC法可提高检测灵敏度。

4 讨论与结论

六味地黄苷糖片是按照由“中药饮片组方(饮片配伍)向中药复方活性成分群组方(组分配伍)发展”的中药经典方剂“二次开发”思路，多糖部位是该制剂发挥免疫调节作用的主要部位，但该成分具有难气化、无紫外吸收等特点，导致相关研究成为中药领域的难点[14-16]。本实验采用乙醇、丙酮、乙醚对六味地黄苷糖片多糖部位进行脱脂，并除去色素及小分子杂质。由于HPGPC测定多糖部位相对分子质量以Na2SO4溶液为流动相时，在固定位置有倒峰，从而影响测定，故本实验选择磷酸盐溶液作为流动相。仅以TSK-GEL G4000PWXL色谱柱为固定相时，色谱峰分离度差，而串联TSK-GEL G1000PW色谱柱后峰形和分离效果较好，最终测得其相对分子质量在10万～20万之间。再通过GC-MS法对六味地黄苷糖片多糖部位进行分析，发现它由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸组成，其中葡萄糖含量最高，而且结构中含有糖醛酸，推测该聚糖可能主要由葡萄糖组成，同时各批次之间单糖组成无明显差异。

表5 单糖标准液、多糖水解液中单糖GC保留时间比较(min)

综上所述，本实验完善了六味地黄苷糖片多糖部位原料及制剂的质量标准，可为该制剂质量控制提供理论依据。