LncRNA IGFBP7-AS1对脑胶质瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及机制

杨光伟 邓楠

(1西南医科大学附属中医医院神经外科,四川 泸州 646000；2 泸州市人民医院神经内科)

脑胶质瘤是一种常见的原发性颅内肿瘤，易复发，预后较差〔1〕。胶质瘤的治疗有手术、放疗、化疗等方法，但治疗效果不佳〔2〕。胶质瘤的发病机制尚不十分明确，从基因水平探讨胶质瘤的发病机制，从而进行基因治疗胶质瘤日益受到关注。长链非编码RNA(LncRNA)是一类转录本超过200个核苷酸但不编码蛋白质的，依据其相对于蛋白编码基因的位置，可分为正义、反义、基因内、基因间LncRNA〔3〕。研究显示，LncRNA可参与肿瘤的发生和发展〔4～6〕。如敲减LncRNA HOXC-ASl可通过下调HOXC8表达抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭〔7〕。研究显示，反义LncRNA胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)7-AS1在胶质瘤组织中表达升高〔8〕，但其对胶质瘤细胞生物学行为的影响还未知。本研究主要探讨敲减LncRNA IGFBP7-AS1对胶质瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及可能的调控机制。

1 材料与方法

1.1细胞和实验试剂 正常星形胶质细胞HA1800和脑胶质瘤细胞系U251、A172、U87均购自中国科学院上海细胞所；胎牛血清(FBS)和RPMI1640培养基均购自美国Gibco公司；胰蛋白酶、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、兔抗人IGFBP7单克隆抗体均购自美国Sigma公司；逆转录试剂盒和聚合酶链反应(PCR)试剂盒均购自美国Fermentas公司；鼠抗人B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体均购自美国Cell Signaling公司；Trizol试剂和LipofectamineTM2000试剂盒均购自美国Invitrogen公司；IGFBP7-AS1的si-RNA及阴性对照、IGFBP7过表达载体均购自上海吉凯基因公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白测定试剂盒购自上海碧云天生物技术公司；Annexin V-FITC/PI试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养和分组转染 正常星形胶质细胞HA1800、脑胶质瘤细胞系U251、A172、U87细胞复苏后，加入含10%FBS的RPMI1640培养基，置于37℃、CO2体积分数5%、湿度97%的培养箱中培养。每2～3 d更换新鲜的培养基。细胞融合至80%时，胰酶消化，进行传代培养。取对数生长期的U87细胞，接种于6孔板中，待细胞融合至60%时，参照LiPofectamineTM2000试剂盒操作说明，分别转染IGFBP7-AS1的si-RNA(si-IGFBP7-AS1组)、si-RNA阴性对照(si-con组)、共转染si-IGFBP7-AS1与IGFBP7过表达载体(si-IGFBP7-AS1+pcDNA-IGFBP7组)、si-IGFBP7-AS1与空载体(si-IGFBP7-AS1+pcDNA-control组)。转染后48 h，qRT-PCR检测IGFBP7-AS1、Western印迹检测IGFBP7蛋白评价转染效果。收集细胞用于后续实验。

1.2.2qRT-PCR检测IGFBP7-AS1表达 各组转染后的细胞，预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后，加入Trizol试剂，提取总RNA。微量核酸仪检测细胞RNA的纯度和浓度后，将其逆转录为cDNA。然后以cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR扩增条件：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共35个循环。采用2-△△Ct法计算IGFBP7-AS1的相对表达水平。

1.2.3Western印迹法检测蛋白表达 细胞中加入蛋白裂解液，提取总蛋白，BCA法测定蛋白含量。取适量蛋白，100℃煮沸5 min。变性后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。电泳结束后，湿转至硝酸纤维素膜，5%脱脂牛奶中封闭1 h。加入IGFBP7、Bcl-2和Bax抗体，4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次5 min。然后加入辣根过氧化酶标记的二抗，37℃孵育1 h。TBST再次洗膜后，加入电化学发光(ECL)显影液，避光显影，凝胶成像系统曝光拍照。

1.2.4四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖 各组转染后的U87细胞，以每孔1×103个接种于96孔板中。培养箱中培养48 h后，每孔加入20 μl浓度为5 mg/ml的MTT，培养箱中孵育4 h。吸弃培养基，加入150 μl二甲基亚砜，混合均匀后于酶标仪490 nm处测定吸光度值(A)。

1.2.5Transwell检测细胞的迁移和侵袭 各组转染后的U87细胞，PBS清洗后，加入不含FBS的细胞RPMI1640培养基，调整细胞浓度为5×104个/ml。细胞迁移实验：取100 μl细胞悬液，加入Transwell上室。下室加入500 μl含FBS的RPMI1640培养基。培养48 h后，多聚甲醛固定细胞，结晶紫染色，棉签擦去小室内膜细胞。倒置显微镜观察，随机选取5个视野，计数。细胞侵袭实验：预先将基质胶用RPMI1640培养基稀释(比例1∶8)，铺于Transwell上室，自然晾干。然后再取100 μl细胞悬液，加入铺有基质胶的上室，后续操作同细胞迁移实验。

1.2.6流式细胞仪检测细胞凋亡 各组转染后的U87细胞，以每孔1×104个接种于24孔板中。培养48 h后，胰酶消化，预冷的PBS清洗细胞2次。取1.0×106个细胞，1 000 r/min离心5 min，吸弃PBS。参照Annexin V-FITC/PI试剂盒操作说明，加入400 μl结合缓冲液，移液器轻轻吹打，混悬细胞。加入10 μl Annexin V-FITC，室温避光孵育15 min。再加入5 μl PI，室温避光孵育5 min。最后加入100 μl结合缓冲液，混匀后流式细胞仪检测。

1.3统计学分析 采用SPSS22.0软件进行独立样本t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1IGFBP7-AS1在脑胶质瘤细胞系中的表达 与正常星形胶质细胞HA1800中IGFBP7-AS1表达水平(1.00±0.12)比较，脑胶质瘤细胞系U251、A172、U87显著升高〔(4.12±0.45)、(3.98±0.37)、(3.89±0.41)，P<0.05〕。

2.2敲减IGFBP7-AS1对胶质瘤细胞U251增殖、迁移和侵袭的影响 si-IGFBP7-AS1组IGFBP7-AS1水平显著低于si-con组(P<0.05)，表明si-IGFBP7-AS1转染成功，U251细胞中IGFBP7-AS1敲低。与si-con组比较，si-IGFBP7-AS1组U251细胞A值、迁移和侵袭数显著降低(P<0.05)。见表1、图1。

图1 敲减IGFBP7-AS1对U251细胞侵袭和迁移的影响(结晶紫染色，×200)

2.3敲减IGFBP7-AS1对U251细胞凋亡的影响 与si-con组比较，si-IGFBP7-AS1组U251细胞凋亡率和Bax蛋白表达显著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05)。见表1，图2，图3。

图2 敲减IGFBP7-AS1对U251细胞凋亡的影响

图3 敲减IGFBP7-AS1对U251细胞凋亡相关蛋白表达的影响

2.4敲减IGFBP7-AS1对U251细胞中IGFBP7表达的影响 与si-con组U251细胞IGFBP7蛋白表达水平(1.00±0.13)比较，si-IGFBP7-AS1组(0.32±0.04)显著降低(P<0.05)。见图4。

1～4：si-con组;si-IGFBP7-AS1组;si-IGFBP7-AS1+pcDNA-control组;si-IGFBP7-AS1+pcDNA-IGFBP7组图4 Western印迹检测U251细胞中IGFBP7的表达

2.5过表达IGFBP7逆转敲减IGFBP7-AS1对U251细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用 si-IGFBP7-AS1+pcDNA-IGFBP7组U251细胞IGFBP7蛋白表达水平(0.91±0.05)显著高于si-IGFBP7-AS1+pcDNA-control组(0.34±0.05，P<0.05)，表明转染成功。见图4。与si-IGFBP7-AS1+pcDNA-control组比较，si-IGFBP7-AS1+pcDNA-IGFBP7组U251细胞A值、迁移和侵袭数显著升高(P<0.05)。见表2。

2.6过表达IGFBP7逆转敲减IGFBP7-AS1对U251细胞凋亡的促进作用 与si-IGFBP7-AS1+pcDNA-control组比较，si-IGFBP7-AS1+pcDNA-IGFBP7组凋亡率和Bax蛋白表达显著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.05)。见表2，图5。

1～2：si-IGFBP7-AS1+pcDNA-control组;si-IGFBP7-AS1+pcDNA-IGFBP7组图5 U251细胞中凋亡相关蛋白的表达

3 讨 论

随着对LncRNA研究的深入，发现LncRNA参与调控细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为，在肿瘤的发生发展中起重要作用〔9〕。

细胞的异常增殖可引起肿瘤的发生〔10〕。诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗的主要作用机制。本研究结果说明IGFBP7-AS1影响胶质瘤细胞的恶性生物学行为，是胶质瘤治疗的潜在作用靶点。Bax是一种促凋亡蛋白，Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，两者参与细胞凋亡过程。Bax表达升高可促进细胞凋亡，而Bcl-2表达升高则抑制细胞凋亡〔11〕。敲减IGFBP7-AS1抑制了胶质瘤细胞Bcl-2蛋白表达，促进了Bax蛋白表达，与相关研究报道结果一致〔12〕，提示IGFBP7-AS1通过调控胞Bcl-2和Bax蛋白表达诱导胶质瘤细胞凋亡。

IGFBP7是一种可调节细胞增殖、黏附及血管形成的可溶性蛋白，参与结肠癌、多发性骨髓瘤等肿瘤的发生和发展〔13，14〕。Jiang等〔15〕研究显示，IGFBP7表达与胶质瘤肿瘤等级、患者总体存活率相关，抑制IGFBP7表达可抑制胶质瘤细胞的增殖和迁移。本研究结果提示IGFBP7-AS1通过下调IGFBP7表达影响胶质瘤细胞的恶性生物学行为，原因可能是IGFBP7-AS1水平降低可通过影响IGFBP7基因启动子区域的组蛋白去乙酰化酶的富集，使IGFBP7基因启动子区域的组蛋白乙酰化水平发生改变，从而抑制IGFBP7基因转录〔16〕。