TGF-β1 通过肾素(前体)受体和V-ATP 酶诱导人腹膜间皮细胞转分化

龙作鹏 程丽慧 符微微 宋科秀

T(三亚市人民医院肾内科，海南 三亚 572000)

腹膜透析(PD)是一种肾脏替代疗法，具有许多独特的优点，但是腹膜纤维化可改变腹膜功能并限制PD治疗时间〔1〕。转化生长因子(TGF)-β1是引起腹膜纤维化和人腹膜间皮细胞(HPMCs)损伤的重要介质〔2，3〕。TGF-β1刺激成纤维细胞增殖并增加许多细胞外基质成分的合成。尽管瞬时 TGF-β1活性增加参与组织的修复和再生，但持续的 TGF-β1刺激可导致组织过度纤维化〔4，5〕。无论是由感染、缺血、炎症还是手术引起的腹膜损伤，都可导致腹膜纤维化，TGF-β1 是该过程的主要调节因子。腹膜损伤时组织和细胞同时发生结构变化和功能下降，如酸性细胞器(主要是溶酶体) 裂解。TGF-β1在伤口愈合和对伤害的反应很重要，也是腹膜中关键的纤维生长因子并介导腹膜纤维化。肾素/肾素前体受体〔(P)RR〕可与肾素及肾素前体结合，增强组织肾素-血管紧张素系统(RAS)活性，同时诱导非RAS 的细胞内信号转导，如在丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路中引起细胞增殖，上调促TGF-β1和纤维化因子等表达增加。 研究发现(P)RR的功能与V-ATP酶有重要联系，参与细胞器酸化和细胞囊泡介导的细胞内蛋白质运输〔6～8〕。(P)RR几乎表达于体内所有的组织中，参与多种疾病的发生发展。TGF-β1已被证实可通过V-ATP酶介导的相关信号通路参与肾小管上皮细胞损伤〔9〕，然而TGF-β1与(P) RR、V-ATP酶是否参与腹膜纤维化的发生，目前尚不明确。本研究旨在探讨 TGF-β1与(P)RR、 V-ATPase在 HPMC转分化中的作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1主要试剂 山羊抗人(P) RR 抗体购自 Santa Cruz公司；小鼠抗人 V-ATPase 单克隆抗体、TGF-β1、TMEPAI纯品购自 Sigma 公司；纤维化蛋白FBRS试剂盒购自大连生工；免疫荧光染色试剂盒购自索莱宝。

1.2HPMCs 的分离、培养、鉴定 从接受腹部手术患者的网膜组织收集 HPMCs。 所有患者签署知情同意书。使用胰蛋白酶-EDTA方法分离 HPMCs，并在含有20%胎牛血清(FBS)的 M199 培养基中培养。通过细胞角蛋白和血管平滑肌肌动蛋白(α-SMA) 的免疫荧光染色来筛选 HPMCs 群体。为了最大限度地减少成纤维细胞的污染，使用鹅卵石形状的 HPMCs，如果成纤维细胞样细胞的含量>5%，则丢弃细胞。将细胞汇合铺板并使其在含 1% FBS 的 M199 培养基中静置 24 h以使其生长同步。通过掺入 5-溴-2脱氧尿苷(BrdU)来测量细胞增殖。

1.3分组

1.3.1TGF-β1处理HPMCs mRNA水平检测将细胞以每孔 1×104细胞数接种在96孔板中，随机分为下列各组：对照组(Con组，只加1% FBS 的 M199 培养基)，1 ng/ml TGF-β1组，2 ng/ml TGF-β1组，3 ng/ml TGF-β1组，4 ng/ml TGF-β1组，5 ng/ml TGF-β1组；每组又分为药物刺激24 h、48 h和72 h 3个亚组，因此共检测18个亚组中(P)RR和V-ATPase基因的表达。

1.3.2(P)RR-siRNA细胞转染 将细胞以每孔1×104细胞数接种在96孔板中，(P)RR-siRNA转染24 h后，将细胞在1%FBS的M199培养基中培养24 h，然后用2 ng/ml TGF-β1处理 24 h。分组：共分为4组，Con组、TGF-β1刺激组、TGF-β1+si-N组(转染非靶向siRNA)和TGFβ1+si-(P)RR〔转染靶向(P) RR的siRNA〕组。以上每组4个复孔。

1.4细胞内(P)RR 和 V-ATPase 的 Western 印迹 蛋白溶解液将细胞裂解后，取50 μg总蛋白以10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，电转移蛋白至硝酸纤维素膜上，在室温下用含3%牛血清白蛋白(BSA)和5%脱脂奶粉的封闭液封闭，分别与抗(P)RR单克隆抗体、抗V-ATPase多克隆抗体孵育杂交，辣根过氧化物酶(HRP)标记的多克隆山羊抗兔免疫球蛋白或山羊抗小鼠免疫球蛋白用作Western印迹分析的二抗。用ECL显影剂显影。通过光密度测定法定量阳性免疫反应条带，并与人β-actin 表达进行比较。

1.5细胞内(P)RR和V-ATPase基因表达的RT-PCR检测 Trizol法提取细胞总RNA，用紫外分光光度计测总RNA纯度，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA污染和降解状况。按逆转录试剂盒(美国Promega公司)说明书方法先逆转录合成第1条cDNA，再以此 cDNA 为模板进行 PCR，引物序列(P)RR：上游引物：5′-GACCTTTGCCATGTGCTTCCT-3′；下游引物：5′-CCAAAAAC-TATTCCAGCACCCA-3′；β-actin：上游引物：5′-CTGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3′，下游引物：5′-CGCAACTAAGTCATAGTCCGCC-3′；V-ATPase：上游引物：5′-TCCGGAGCGCAAA TACTCTGT-3′，下游引物：5′-CCGGCTTCATCGTATTCCTGT-3′。 反应条件为：预变性97℃30 s，变性92℃30 s，退火62℃ 30 s，延伸 72℃50 s，32 次循环，PAI-1循环27次，结束循环后再延伸72℃ 50 s，35℃终止。PCR产物经凝胶电泳分离，进行凝胶扫描和分析，以目的片段/内参照GAPDH片段的条带光密度的比值作半定量比较。

1.6统计学方法 采用SPSS20.0软件进行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1TGF-β1对HPMC中(P)RR和V-ATPase基因及蛋白表达的影响 (P)RR和V-ATPase mRNA 表达水平随TGF-β浓度增加和孵育时间的延长而上调，且均显著高于Con组(均P<0.05)。见图1、表1。

2.2敲减(P)RR可抑制HPMCs中TGF-β1诱导的(P)RR 和 V-ATPase表达增加 TGF-β1组(4.23±0.98)、TGF-β1+si-N组(3.42±1.05)、TGF-β1+si-(P)RR组(2.48±0.56)组V-ATPase蛋白表达水平均显著高于Con组(1.00±0.00，P<0.05)，且TGF-β1+si-(P)RR组V-ATPase蛋白表达水平显著低于TGF-β1+si-N组(P<0.05)。见图2。

图2 (P)RR敲低降低TGF-β1诱导的V-ATPase蛋白表达水平

3 讨 论

腹膜病变患者长期在高糖、细菌脂多糖、金葡菌肠毒素、终末糖基化产物、腹透液增塑剂、血管紧张素Ⅱ、多种炎性细胞因子等各种内、外源性因素的刺激下，可以引起内源性TGF-β1升高〔10〕，而TGF-β1是腹膜纤维化病变中最重要的促发因子之一。研究表明TGF-β1通过Smad3信号通路调节许多基因 (Collagen Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ，α-SMA等)表达，使腹膜间皮细胞发生 EMT，最后导致腹膜纤维化的发生与发展〔11〕。此外TGF-β1还可以活化MAPK的全部3条通路〔12〕。 研究发现MAPK 尤其是p38 MAPK通路与促进ECM产生〔13，14〕和抑制ECM 降解的关系，说明MAPK作为TGF-β1的下游信号通路在纤维化病变机制中具有重要意义。(P)RR已被证明在组织RAS中发挥关键作用，其自身细胞内信号传导诱导的作用在高血压和糖尿病终末器官损伤的发展中发挥重要作用。(P)RR的一个片段也被称为ATP6AP2，与空泡H+-V-ATPase(V-V-ATPase)相关V-V-ATPase是一种多亚基质子泵，参与细胞生理学的各种基本方面，包括受体介导的内吞作用和回收、蛋白质和信号分子的加工、膜分选和运输以及溶酶体/自噬体酶的激活。(P)RR和V-V-ATPase定位于HPMCs酸性细胞器中。HPMCs酸性细胞器中的(P)RR和V-ATP酶在促纤维化分子细胞信号传导和转运运中发挥作用，在其他细胞中也有类似报告〔7，15〕。TGF-β1 及(P)RR、V-ATPase 都参与细胞纤维化中的作用。

综上，TGF-β1可通过刺激(P)RR过表达途径而促进HPMC 的转分化。通过RNAi技术干扰(P)RR基因表达，可以下调(P)RR 和V-ATPase蛋白表达，抑制HPMC 的转分化。