苏葶平喘汤对难治性哮喘小鼠模型c-jun表达的影响*

宋桂华，周琼阁，张 岩，管志伟，吕伟刚 ，郭彦荣，张冰雪，彭明浩

(1.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000； 2.河南中医药大学，河南 郑州 450046)

支气管哮喘是一种以慢性气道炎症和气道高反应性为特征的异质性疾病，规范治疗3～6个月仍不能达到良好控制的哮喘称之为难治性哮喘，激素抵抗是难治性哮喘的主要原因之一[1-2]。难治性哮喘占支气管哮喘的5%～10%，不仅严重影响儿童的身心健康及生活质量，还给家庭和社会带来沉重的精神和经济负担[3-4]。核转录因子激活蛋白-1(nuclear transcription factor activator protein-1，AP1)蛋白产物c-jun的表达与激素抵抗型哮喘的发生、发展及预后有着密切的关系，因其可能参与降低糖皮质激素的抗炎活性而致糖皮质激素抵抗，从而发展为难治性哮喘[5-6]。研究[7-9]表明，中医药治疗难治性哮喘有独特优势，已成为研究热点。课题组综合多年来临床治疗儿童难治性哮喘的经验，基于痰瘀互结之理论，创立苏葶平喘汤，临床疗效显著，但缺乏客观依据来验证。故本研究通过建立难治性哮喘小鼠模型研究苏葶平喘汤对难治性哮喘小鼠肺部病理改变及肺组织c-jun表达的影响，探讨苏葶平喘汤治疗儿童难治性哮喘的作用机制，为该方的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动 物

无特定病原体(specified pathogen free，SPF) 级BALB/C雌性小鼠50只，6～8周龄，体质量20～22 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司[许可证号SCXK(鲁)20140007]，动物质量合格证号为37009200016677。动物实验于河南省中医药研究院动物中心SPF级动物房[许可证号SYXK(豫)2019-0001]完成。本研究获得河南中医药大学医学伦理委员会审核批准(审批编号20180829001)。 动物购买后适应性饲养7 d，然后进行实验。

1.2 药品、试剂与仪器

苏葶平喘汤组成：紫苏子10 g，葶苈子10 g，蜜紫菀10 g，款冬花10 g，浙贝母10 g，姜半夏10 g，胆南星10g，橘红6 g，茯苓10 g，地龙6 g，赤芍6 g，川芎6 g，甘草片 6 g。药材由河南中医药大学第一附属医院中药房提供。所有药材经浸泡、煎熬、过滤，浓缩成100 mL药汁，1 mL含0.71 g生药。将药汁装入已消毒容器中，置于4 ℃冰箱保存。地塞米松注射液，2 mL∶5 mg，河南润弘制药股份有限公司产品,批号21901131；氯化钠注射液，500 mL∶4.5 g，河南科伦药业有限公司产品,批号A18121804-1。卵清蛋白(OVA)Grand Ⅴ、Grand Ⅱ，Sigma公司产品，批号依次为SLBK6455V，SLBP0782V；氢氧化铝 [AL(OH)3]粉，500 g/瓶，天津市科密欧化学试剂有限公司产品，批号20180902；水合氯醛，郑州派尼化学试剂厂产品，批号180408；40 g/L多聚甲醛通用型组织定液,武汉赛维尔生物有限公司产品，批号YP184309；c-jun试剂盒，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司产品，批号PSHNDEFJE3；总核糖核酸(RNA)提取试剂盒，北京索莱宝科技有限公司产品，批号R1200；逆转录试剂盒，Promega公司产品，批号0000280839；荧光定量试剂，Roche公司产品，批号06402712001；引物，上海生物工程有限公司产品。NE-C900型雾化吸入器，欧姆龙有限公司产品；光学显微镜，德国徕卡公司产品；DFC420型彩色冷CCD及图像分析系统，德国徕卡公司产品；ST360型酶标仪，上海科华生物工程股份有限公司；MY-10型手持式组织研磨器，上海净信实业发展有限公司产品； NanoDroP2000型微量核酸测量仪，美国赛默飞世尔科技公司产品；LCZ480型荧光定量PCR仪，美国罗氏诊断产品有限公司产品；无酶离心管，爱思进生物科技有限公司产品。

1.3 动物分组及模型的建立

将50只小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、苏葶平喘汤组、地塞米松组，苏葶平喘汤和地塞米松组，每组10只。按照参考文献[10-11]复制难治性哮喘小鼠模型，分为致敏和激发两个过程：致敏期2周，激发期从第3周开始，维持共11周。造模完成，经组织病理学鉴定模型制备成功。

1.4 治疗方法

自激发第7周起，各组进行如下处理。苏葶平喘汤组：灌胃苏葶平喘汤水煎剂16.68 g/(kg·d)(按正常人体剂量9.1倍进行折算)，并腹腔注射0.5 mL生理盐水。地塞米松组：灌胃生理盐水0.5 mL；并给予地塞米松1 μg/(g·d)，腹腔注射 0.5 mL。苏葶平喘汤和地塞米松组：灌胃苏葶平喘汤水煎剂16.68 g/kg；并给予地塞米松针1 μg/(g·d)，腹腔注射0.5 mL。空白对照组和模型对照组给予等量生理盐水进行灌胃和腹腔注射。各组均1 d 1次，连续3周。

1.5 检测指标与方法

末次给药24 h内给予各组小鼠腹腔注射质量分数为40 g/L的水合氯醛(10 μL/g体质量)进行麻醉，快速眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠，立即摘取肺组织。取全血置于普通试管内，静置2 h后，离心半径10 cm，转速3 000 r/min离心15 min，取上清液于-80 ℃冻存备用。取小鼠左肺组织，以40 g/L甲醛固定，石蜡包埋，切片，常规制备病理切片，苏木精-伊红(HE)染色。取右肺放入无酶的微型离心管中，置于-80 ℃冰箱内，以备逆转录聚合酶链反应(PCR)检测。200 倍光学显微镜下观察肺组织的病理学改变，以实时聚合酶链反应检测c-jun表达水平。

1.6 统计学方法

2 结 果

在实验过程中，小鼠共死亡3只。苏葶平喘汤组死亡1只，发生在造模过程中，考虑为难治性哮喘急性发作所致。苏葶平喘汤和地塞米松组死亡2只，其中1只在灌胃后死亡，考虑灌胃过程中操作失当而致；另外1只小鼠考虑长期腹腔注射导致腹腔感染而致。

2.1 肺组织病理学改变

空白对照组小鼠肺组织未见炎性改变。模型对照组支气管管壁厚度增加，支气管管壁及周围均可见大量炎症细胞浸润，管腔狭窄，形状不规则，管腔内可见大量黏液分泌。3个药物组较模型对照组支气管病变减轻，以地塞米松组+苏葶平喘汤组最优。见图1。

2.2 实时荧光定量RT-PCR检测各组小鼠肺组织中c-Jun mRNA的表达

2.2.1 各组小鼠肺组织中c-Jun mRNA的扩增曲线

见图2。

图2 各组小鼠肺组织中c-Jun mRNA的扩增曲线图

2.2.2 各组小鼠肺组织中c-Jun mRNA的溶解曲线

见图3。

图3 各组小鼠肺组织中c-Jun mRNA的溶解曲线图

2.2.3 各组小鼠肺组织中c-Jun mRNA的表达

与空白对照组对比，模型对照组c-Jun mRNA表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组对比，3个药物组的c-Jun mRNA表达减少(P<0.05)。3个药物组的c-Jun mRNA组间对比,差异无统计学意义。见表1。

表1 各组小鼠肺组织中c-Jun mRNA的表达

3 讨 论

美国科学家Lee等[12]首次发现了核转录因子激活蛋白-1(Nuclear transcription factor activator protein-1，AP1)，并鉴定其为转录因子。AP1是Jun、Fos、ATF和MAF形成的同源或异源二聚体[13]，其中最为稳定的AP1二聚体形式是由c-Fos和c-Jun组成的[14]。在正常情况下，AP1的蛋白水平和活性很低。当受到外来刺激(如生长因子、趋化因子、细胞因子、神经介质激素及环境压力等)时，AP1被激活，可调节基因的表达参与细胞增殖、分化、凋亡等多个调节过程[15]，对免疫炎症性疾病[16-17]的发生发展起重要作用。具体来说，AP1可通过调控先天性免疫系统的活性，与其他家族的转录因子协同作用，调控原始T细胞分化，与糖皮质激素受体相互作用或通过反式抑制等方式来参与机体的炎症反应[18]。哮喘作为一种气道慢性炎症性疾病，可使AP1的活性增强，而糖皮质激素作为机体重要的应激激素和临床常用的抗炎、抗免疫药物，可下调AP1的表达。难治性哮喘以病情反复、难以控制为主要特点，是一种吸入中高剂量糖皮质激素等药物足剂量足疗程仍不能达到良好控制的哮喘，其糖皮质激素抵抗作用受糖皮质激素受体、转录因子、调节性T细胞、辅助性T细胞、P糖蛋白及巨噬细胞游走抑制因子的影响[19]。其中AP1对难治性哮喘患者糖皮质激素抵抗作用的影响主要体现在：①AP1的过度活化可影响JNK/AP-1信号通路，阻断糖皮质激素受体与糖皮质激素反应单元及其他转录因子的结合，发挥抑制作用[20];②抑制了糖皮质激素抗胶原生成的作用，使成纤维细胞产生胶原增多，加重了气道重构，使支气管壁硬化，减弱了糖皮质激素的治疗作用[21]。

苏葶平喘汤为自拟方，由苏葶丸合涤痰汤化裁而来，辅以活血化瘀之赤芍、川芎、地龙。《医宗金鉴》曰：“痰饮壅逆因作喘，痰饮苏草滚痰从，停饮喘急不得卧，泻饮降逆苏葶功。”苏葶丸由紫苏子、葶苈子组成，治疗急性支气管炎和哮喘疗效确切[22-25]。涤痰汤是中医治疗痰证的一首古方，在《奇效良方》及《证治准绳》中均有记载[26]，由胆南星、半夏、枳实、茯苓、橘红、石菖蒲、人参、竹茹、甘草组成。该方本为中风后痰迷心窍而用，古方今用，被用于支气管炎哮喘的治疗，对抑制气道重塑、缓解气道炎症反应有积极作用[27]。

方中紫苏子主治咳逆痰喘，润心肺，尤能下气定喘，止嗽消痰，利膈宽胸，温中开郁。葶苈子滑润而香，泻肺定喘。肺为水源，葶苈子不仅能泻肺气还能泻肺水。紫苏子与葶苈子共为君药。紫菀、款冬花降气平喘，疏利开通，以利肺气；浙贝母清热化痰，开宣肺气。半夏辛温性燥，能燥湿化痰，和胃降逆；胆南星、橘红可加强半夏燥湿化痰的作用，且橘红有理气行滞之功，与半夏合用体现了治痰先理气、气顺则痰消的治疗理念。肺脾不足，风邪乘之，而痰壅其经络。茯苓益气补脾，以杜绝生痰之源。以上各药共为臣药。地龙性走窜，搜风剔络以止咳平喘。现代药理学研究证实，地龙可抑制肺组织平滑肌肌动蛋白及纤维连接蛋白，松弛气管平滑肌，改善气道纤维化，防止气道重塑，其有效成分琥珀酸和次黄嘌呤具有平喘止咳的功效[28-29]。赤芍、川芎活血化瘀，可消除肺微血管痉挛，改善局部微循环，减轻肺纤维化[30-31]。地龙、赤芍、川芎为佐药。甘草既可助茯苓益气健脾，又可调和诸药，为使药。诸药合用，共奏祛痰通络、活血化瘀之功，组方精炼，配伍严谨，升中有降，开中有合，寒温得宜，使宣降得复、痰饮得消、瘀血得散，喘证自平。

本研究结果证实了苏葶平喘汤能有效抑制激素抵抗型哮喘小鼠体内AP1产物c-Jun的表达，并能改善肺部炎症的浸润，揭示了该方治疗激素抵抗型哮喘的主要作用机制，为中医药更好治疗哮喘提供了科学依据。