液相色谱-质谱法高精准检测兽肉中莱克多巴胺

黄永生　叶夏声　何玉榆　黄婷　陈彤

摘  要：本研究基于液相色谱-串联质谱建立了一种高精准检测盐酸莱克多巴胺的方法，对所建立的方法进行了方法学的考察与验证。参考相关标准，对标准的前处理步骤进行优化，采用液相色谱-串联质谱法进行分析。其标准曲线相关系数为0.999 93，方法检出限为0.068 8 μg/kg，回收率范围为93.4%～100.1%，相对标准偏差为1.1%～3.7%。所得结果表明该方法检出限较低，回收率好，处理步骤简单，得到的结果精准度高，重复性好，为莱克多巴胺的检测提供了新思路。

关键词：莱克多巴胺;液相色谱-串联质谱;前处理优化;高精密度

中图分类号：S859.84 文献标志码：A 文章编号：1001-0769（2022）04-0085-04

盐酸莱克多巴胺（ractopamine，RAC），别名雷托巴胺、舒喘灵、金莱多巴、权莱克、Paylean，化学名称为4-[3-[2-羟基-2-（4-羟基苯基）-乙基]氨基丁基]苯酚（4-[3-[2-hydroxy-2-（4-hydroxyphenyl）-ethyl]aminobutyl]phenol），是美国研制合成的一种β-肾上腺受体激动剂类化合物，但被非法商家用作新一代的瘦肉精，被添加于饲料产品中，用于替代克伦特罗来提高动物生产效率[1]。相比克伦特罗，RAC具有毒性小、代谢快的特性，故各国政府对其在养殖业中适用范围的规定各不相同。目前，在美国、日本、墨西哥、澳大利亚等国家，RAC可作为瘦肉精被用在养殖生产中，以此来提高畜禽的蛋白质含量及瘦肉率。但消费者大量食用含RAC残留的肉制品后，大概率会引发中毒症状，如恶心、呕吐、头晕、头痛、肌肉震颤、心悸、心律失常、血压上升等，严重时甚至会影响生殖系统[2-4]。故为了国民身体健康安全，我国政府已经对该类药物实施全面禁用，农业农村部在第235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中将莱克多巴胺及其盐类物质列为检测药品，并于2011年12月5日起在中国境内禁止生产和销售RAC;在第176号等公告中明确了在动物饲养过程中禁止使用盐酸克伦特罗。

目前，对莱克多巴胺的检测有多种方法，主要有气质联用法、高效液相色谱法、酶联免疫法、毛细管电泳技术、液相色谱—质谱法         等[5-7]，但这些方法大多存在前处理过程繁琐、复杂、费时的缺点，快速检测的方法则存在精准度低、检测对象单一等不足。故本研究基于农业农村部1025公告-18-2008《动物源性食品中β-受体激动剂残留检测 液相色谱-串联质谱法》、GB/T21313-2017《动物源性食品中β-受体激动剂残留检测方法 液相色谱-质谱/质谱法》、GB/T22286-2008《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定 液相色谱串联质谱法》等[8-10]，建立了一种样品的快速净化手段，缩短了前处理的时间，有效地提高了检测工作的效率。

1  材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

安捷倫1290液相色谱仪、AB Science质谱仪、氮吹仪、多管漩涡混合仪、天平、旋涡混合器、冷冻离心机、超纯水仪、超声波清洗机、混合阳性离子（mixed-mode cation exchanger，MCX固相萃取柱（规格为3 cc、60 mg）、恒温水浴摇床。

1.1.2 药品与试剂

0.2 mol/L乙酸铵（pH=5.2）;0.1 mol/L高氯酸溶液;5%氨化甲醇;甲醇（色谱纯）、甲酸（色谱纯）;乙酸（分析纯）;氢氧化钠（分析纯）;β-葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶（20 U/mL）;复溶液：甲醇/水/甲酸（v/v/v =10∶90∶0.09）。

1.2 样品准备

取适量新鲜牛肉组织，将其搅碎为肉质均匀的状态，于-20 ℃避光保存。

1.3 标液配制

准确称取莱克多巴胺的标准品，用甲醇配成100 μg/mL的标准储备液，-18 ℃冰箱中保存，有效期6个月;再分别移取适量的莱克多巴胺标准储备液，用甲醇逐级稀释成适当浓度的莱克多巴胺标准工作液。

1.4 样品前处理

准确称取2.00 g（±0.01 g）试样，置于50 mL离心管中，加入8.0 mL 0.2 moL/L乙酸铵溶液（pH=5.2）和40 ?L β-葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶（20 U/mL），加盖     2 000 r/min涡旋振荡8 min，37 ℃恒温摇床避光酶解18 h。酶解后放置至室温，在酶解液中加入300 ?L高氯酸（将pH调至1.00），涡旋30 s，10 000 r/min低温离心5 min，移上清液于另一离心管中。在残渣中加入2 mL 0.1 mol/L高氯酸溶液，涡旋30 s，10 000 r/min 低温离心5 min，合并上清液。上清液中加入570 μL 5 mol/L的NaOH（将pH调至4.00），备用。

MCX固相萃取柱分别依次用5 mL甲醇、5 mL水活化。取备用液全部过柱，再依次用   5 mL水、5 mL甲醇淋洗小柱，抽干。用5 mL 5%氨化甲醇洗脱，收集至15 mL塑料离心管。洗脱液在50 ℃下氮气吹干，用复溶剂将浓缩液定容至1 mL，剧烈振荡5 min，用1 mL针筒移取过0.22 μm滤膜，供液质仪测定。

2  结果与讨论

2.1 标准曲线

按照农业农村部1025号公告-18-2008《动物源食品中磺胺类药物残留检测液相色谱-串联质谱法》标准条件设置仪器参数，配制一系列浓度的标准样品溶液（0.25 μg/kg、   0.50 μg/kg、1.00 μg/kg、2.50 μg/kg、5.00 μg/kg），待仪器基线稳定后，对系列标准样品溶液进行测定，绘制标准曲线，其相关系数为R2=0.999 93。

2.2 检出限测定

使用空白牛肉样品做基质，设置一个浓度C （0.25 μg/kg）的阳性样，按照操作进行前处理，之后上机测定，测得莱克多巴胺的信噪比为S/N=10.9，可计算检出限（method detection limit，MDL）为0.068 8 μg/kg。计算公式如下：

检出限（MDL）（μg/kg） =3C/（S/N）

2.3 方法精密度和回收率测定

以空白牛肉样品为基質，进行加标回收试验，加标浓度为0.25 ?g/kg、0.50 ?g/kg、 2.50 ?g/kg。将加标样品和空白样品按方法进行前处理，上机测试，方法精密度和回收率结果分别见表1、表2所示。根据表1与表2中相对标准偏差和回收率结果可发现，该方法的相对标准偏差较低，且回收率表现较好，莱克多巴胺的回收率介于93.4%～100.1%，相对标准偏差为1.1%～3.7%。该方法的检出限较低、重复性较好，也能保持较为优异的回收率，可用于莱克多巴胺的准确定性、定量 检测。

3  结论

本研究提出了一种高效检测莱克多巴胺的方法，优化了相关标准提取步骤，采用乙酸铵对酶解后的牛肉进行提取，提取离心后过固相萃取柱进行净化，利用液相色谱-串联质谱进行测定。整个过程所进行操作简单，对前处理过程设备要求低，所需溶剂相对较少。同时，结果表明，该方法的检出限低，回收率较好，且重复效果好，有效地消除了基质效应的干扰，提高了莱克多巴胺的方法检测的准确性及精密度，有效地节约了检测时间和人力，提升了检测的效果。通过多种食品样品的实测实验证明，本方法适用于畜禽肌肉组织中莱克多巴胺的快速定性、定量检测。

参考文献

[1] 张振玲，特里纳·海因.关于第二代瘦肉精—盐酸莱克多巴胺[J].猪业科学，2021，38（10）：20-22.

[2] 张剑波，刘翌阳，陶炜煜，等.近10年中国生猪产业回顾与未来展望[J].农业展望，2018，14（1）：35-42.

[3] 石静飞.沙丁胺醇和莱克多巴胺在猪和山羊体内的代谢及组织残留预测研究[D].武汉：华中农业大学，2014.

[4] 李苗，马月姣，李建成.动物产品中莱克多巴胺的残留检测研究进展[J].中国兽药杂志，2022，56（5）：69-79.

[5] 金雁，姜莉，刘宁，等.高效液相色谱法同时测定猪肉中克伦特罗、沙丁胺醇、土霉素、四环素残留量的研究[J].现代仪器，2007，13（2）：65-67.

[6] 董科，刘超，朱慧敏，等.浅析莱克多巴胺的危害及检测方法[J].南方农业，2021，15（30）：190-191.

[7] 张洋.LC-MS/MS法同时快速检测牛肉中12种β-受体激动剂的应用研究[J].食品安全导刊，2020（26）：71-75.

[8]动物源性食品中β-受体激动剂残留检测方法 液相色谱-质谱/质谱法：GB/T 21313-2007[S].2007.

[9] 农业农村部1025号公告-18-2008， 动物源性食品中β-受体激动剂残留检测 液相色谱-串联质谱法[S/OL].http：//www.moa.gov.cn/nybgb/2008/dwuq/201806/t20180609_6151576.htm.

[10]动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定 液相色谱串联质谱法：GB/T 22286-2008[S].2008.