长双歧杆菌F16菌株胆盐水解酶基因的鉴定及产酶条件优化

冯诗诗田 青胡 军

(1.河南工业大学 生物工程学院,河南 郑州 450001;2.工业微生物菌种保藏与选育河南省工程实验室,河南 郑州 450001;3.郑州大学 基础医学院,河南 郑州 450001)

益生菌在人体健康方面发挥着重要作用[1-4],尤其是在降胆固醇的作用上,人体血清中的胆固醇含量与心血管疾病关系密切[5],主要发挥降解作用的是乳酸菌[6-7],其中双歧杆菌降解效果显著[8-9]。肠道胆固醇的吸收主要是胆酸的乳化作用,菌株产生的BSH可将结合型胆酸盐类水解成游离型胆酸氨基酸残基[10-11],经肠肝循环进一步分解胆固醇,或不参与肠肝循环随粪便排出,从而达到降低胆固醇的目的[12-13]。体外研究表明:胆固醇可与游离胆汁酸、菌体细胞发生共沉淀作用,降解培养基中的胆固醇[14]。双歧杆菌是严格的厌氧菌,对驯化后的菌株对氧气有一定的耐受性,前期在益生性实验中发现其具有显著的胆固醇降解作用,在48 h内降解率可达到50%,72 h可达到70%,由于该菌株在48 h时的活性比72 h高,故选用48 h为优化培养的周期。

为深入探究长双歧杆菌F16对胆固醇的降解作用,对BSH及其基因进行鉴定,分析菌株对胆固醇的降解作用与产BSH的关系,并采用响应面分析法建立模型,优化菌株的产酶条件,提高BSH活性,从而为长双歧杆菌F16在食品、保健和医药等方面的综合应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试 剂

菌种来源:实验所用菌株F16取自郑州大学某实验室一株经过长期驯化的益生菌。

蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、琼脂粉、葡萄糖、柠檬酸氢二铵、吐温-80、K2HPO4、KH2PO4、乙酸钠、硫酸镁、硫酸锰(BC),天津市大茂化学试剂厂;三氯乙酸、茚三酮、碘酸钾、果糖、琼脂糖、胆固醇、牛胆酸钠、Marker、Ezup柱式细菌基因DNA抽提试剂盒,生工生物工程(上海)股份有限公司。

MRS培养基:蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、酵母粉5 g、葡萄糖20 g、吐温-80 1 mL、乙酸钠5 g、柠檬酸氢二氨2 g、硫酸镁0.58 g、硫酸锰0.25 g、磷酸氢二钾2 g、琼脂粉20 g、蒸馏水1 000 mL,121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

1.2 仪 器

YQX-Ⅱ厌氧培养箱,上海跃进医疗器械有限公司;JY600D电泳仪,北京君意东方电泳设备有限公司;Eppendorf MastercyclernexusPCR仪,艾本德中国;EPOCH微孔板分光光度计,美国伯腾仪器有限公司;Heraeus Fresco 21高速冷冻离心机,热电实验设备有限公司奥斯特罗德分公司;ZHJH-C1109B型超净工作台,上海智诚分析仪器制造有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株的活化

取甘油保存的F16菌液,接入新鲜的MRS液体培养基中,37 ℃厌氧培养72 h以上(第1次活化时间较长),之后每次传代培养48 h即可。

1.3.2bsh的鉴定

菌悬液的制备:将活化后的长双歧杆菌接入MRS液体培养基中,厌氧培养48 h后,4 ℃下10 000 r/min离心10 min,弃去上清液,用PBS将菌体洗涤2次,调节菌体的OD600为1。

采用牛津杯法[15],加入0.3%的牛磺酸钠于MRS培养基,将上述菌悬液注入牛津杯中,培养48 h或72 h,观察是否有白色沉淀以及茚三酮显色反应是否有蓝紫色颜色变化,以此来鉴定胆盐水解酶[16]。

1.3.3bsh基因的鉴定

通过检索NCBI的双歧杆菌序列,设计了一组bsh基因的特异性引物:bsh上游引物为5’-TGAGGTCCATGGAGCTGGGTTTGAAGA-3’;BSH下游引物为5’-GTATCATGAACGTGCAAGCCAACCAAA-3’。

F16的基因组DNA为模板,使用bsh基因特异性引物进行PCR扩增,反应体系如表1所示。

表1 bsh基因鉴定PCR反应体系Table 1 The bsh gene identifies the PCR system

PCR反应条件:95 ℃预变性3 min,95 ℃变性15 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸1 min 6 s,30次循环,72 ℃延伸5 min。扩增完毕后进行电泳,若得到的基因片段长度与预期相符,将PCR产物纯化回收,送至测序公司测序。

1.3.4 响应面实验设计

在单因素实验(培养温度、培养基pH、葡萄糖质量浓度、蛋白胨质量浓度、酵母浸粉质量浓度和菌液接种量)[17]的基础上,以葡萄糖质量浓度、蛋白胨质量浓度、菌液接种量为自变量,胆盐水解酶活性为响应值,利用Box-Behnken中心组合原理设计3因素3水平的响应面实验[18-19],并采用Designexpert 12软件进行数据分析。

1.3.5 测定方法

将调节好的菌悬液进行冰浴,超声破碎后再离心,取上清液,加入磷酸缓冲液和牛胆酸钠溶液,摇匀,30 min后终止反应,加入茚三酮指示剂煮沸,稀释后在570 nm处测定样品吸光度值,具体测定方法参照文献[20]。

2 结果与分析

2.1 BSH的鉴定结果

将活化后的长双歧杆菌F16的菌液注入含胆盐的MRS的牛津杯中,培养一段时间后,牛津杯底部有白色沉淀,如图1所示。取适量白色沉淀,加入茚三酮显色剂,颜色变为蓝紫色,可初步确定F16产BSH。

图1 牛津杯法鉴定BSH结果Fig.1 Oxfordcup method of BSH results

2.2 bsh基因的鉴定结果

引物扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳,最终得到了一段长度约为1 100 bp的基因片段,其扩增结果如图2所示。图2中:从左至右依次为Marker、引物扩增产物和空白对照。该基因片段与预期相符合,使用生物信息软件将测序结果与已知序列进行比对分析,得出F16-bsh基因片段与已报导的bsh基因(NZ_CP026999.1)同源性为93.97%,F16-bsh基因反向测序序列与已报导的bsh基因序列比较如图3所示,由此可以确定该基因为胆盐水解酶bsh家族基因。实验结果说明长双歧杆菌F16含有bsh基因。

图2 bsh基因扩增结果Fig.2 Results of bsh gene amplification

图3 F16-bsh基因反向测序序列与已报导的bsh基因序列比较Fig.3 The F16-bsh gene reverse sequencing sequence was compared with the reported bsh gene sequence

2.3 响应面优化实验

2.3.1 响应面实验结果与分析

在单因素实验基础上,以葡萄糖质量浓度A、蛋白胨质量浓度B、接种量C为自变量,以BSH活性OD570为响应值进行响应面优化组合实验,方案和结果如表2所示。

表2 响应面设计与结果Table 2 Response surface design and results

采用Designexpert 12软件对表2进行回归分析和显著性检验,建立了葡萄糖质量浓度、蛋白胨质量浓度和接种量3个自变量和BSH活性响应指标关系的二阶多项式方程:Y=0.897 2+0.004 4A+0.000 1B+0.013 0C+0.001 0AB+0.002 3AC-0.003 7BC-0.135 6A2-0.149 6B2-0.086 3C2。

2.3.2 响应面模型的方差分析

对回归模型进行方差分析,结果如表3所示。由表3可知:该回归模型极显著(P<0.000 1),失拟项越小,对应的P值越大,拟合效果越好,该模型的失拟项对应的P=0.065 3>0.05,不显著,其中A,C对BSH活性的影响显著(P<0.05),二次项A2,B2,C2对BSH活性的影响极显著(P<0.01),表明该回归方程的自变量和因变量之间的相关关系显著,模型拟合度高,实际值与预测值较为接近,实验结果准确可行。对回归方程进行可信度分析,得到R2=0.999 2,经调整后R2=0.998 1,表明该模型可以很好地解释72.58%的响应值变动。

表3 响应面实验方差分析Table 3 Regression model analysis of variance

2.3.3 响应面分析

为探索这3个因素之间的交互作用对BSH活性的影响及影响程度,绘制该回归方程的响应曲面,曲面图如图4所示。蛋白胨质量浓度与接种量的等高线比较接近椭圆,且曲面较陡,说明蛋白胨质量浓度与接种量的交互作用对BSH活性的影响较大;葡萄糖质量浓度与蛋白胨质量浓度、葡萄糖质量浓度与接种量的等高线均接近圆形,说明葡萄糖质量浓度与蛋白胨质量浓度、葡萄糖质量浓度与接种量的交互作用对BSH活性的影响不明显。

图4 各因素的交互作用对BSH活性的影响曲面Fig.4 The influence surface of each factor interaction on BSH activity

2.3.4 验证实验

通过Designexpert 12软件分析,可得到BSH活性的最优发酵条件为:葡萄糖质量浓度10.043 g/L、蛋白胨质量浓度14.997 g/L、接种量1.038%,此时BSH活性OD570预测值为0.898。考虑到实际情况,将发酵条件调整为葡萄糖质量浓度10.05 g/L、蛋白胨质量浓度15 g/L、接种量1.05%,进行3次验证实验,得到BSH活性OD570平均值为0.896,与预测值的误差为2.26%,偏差较小,表明响应面法优化发酵条件较为可信。

2.4 F16菌株对胆固醇的降解作用

为验证F16菌株对胆固醇的降解效果,对优化前后的胆固醇降解率进行分析比较,在前期研究中已知胆固醇的标准曲线回归方程为y=0.430 1x+0.003,优化前胆固醇降解率为46%,优化后的胆固醇降解率为72.6%,优化后的降解率约为优化前的1.6倍。

3 结 论

长双歧杆菌F16对胆固醇有较显著的降解效果,采用牛津杯法初步鉴定F16能产胆盐水解酶,根据菌株全基因组序列和已知的bsh基因序列,设计引物并扩增出bsh基因,证明F16具有bsh基因,并得到F16的bsh基因序列,将F16-bsh与已报导的bsh序列进行比对,同源性为93.97%,证明该基因属于bsh家族基因,表明F16具有BSH活性。葡萄糖质量浓度、蛋白胨质量浓度、接种量以及酵母浸粉质量浓度、培养温度、培养基pH会导致BSH活性产生变化,设计响应面实验对长双歧杆菌F16的发酵条件进行优化:葡萄糖质量浓度10.05 g/L、蛋白胨质量浓度15 g/L、接种量1.05%、酵母浸粉质量浓度15 g/L、培养温度37 ℃、培养基pH 5.5,优化后F16菌株长势旺盛,代谢加快,产生的BSH活性明显增加,用OD570表示为0.896,优化后的BSH活性是优化前的1.8倍,优化后的胆固醇降解率约为优化前的1.6倍,表明长双歧杆菌F16菌株产生的BSH活性较高较稳定,降胆固醇效果显著提高,在食品、保健和医药领域具有良好的应用前景。