HPLC检测糕点中阿斯巴甜含量的不确定度评定

唐璐子，张 洋

（安徽国科检测科技有限公司，安徽合肥 230041）

近年来，随着人们对食品中含糖量的关注，诸多甜味剂频繁出现在大众的视野中。甜度高、热量低的特点使这些甜味剂被用来代替膳食中的糖。其中人工合成的阿斯巴甜一直遭受质疑，因为阿斯巴甜在应用中存在诸多隐患，如致癌、诱发脑瘤等，苯丙酮尿症患者应避免使用，过量使用可能会影响人们的生命安全。《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）中规定，糕点中天门冬酰苯丙氨酸甲酯（又名阿斯巴甜）所允许最大使用量为1.7 g/kg[1]。

在检测工作中，检测结论的准确性和质量也被提出了更高的要求，对检验结论的不确定度评定工作倍受重视。食品中测定不确定度的常用方法是A类、B类评定法。A类是对重复性测量的实验数据进行分析计算，B类评定不同于A类评定的方法，是分析实验过程中存在的导致结果不准确的因素，对每个因素造成的误差进行分析计算。

目前，针对食品中阿斯巴甜的检测的有关研究中，虽没有详细资料表明糕点中阿斯巴甜测定的不确定度评定过程，但在全国各地监督抽查和第三方检测公司委托检验过程中，发现在糕点中对阿斯巴甜的应用较多[2-4]。本文基于《测量不确定度的要求》（CNAS—CL 01—G 003：2019）[5]、《化学分析中不确定度的评估指南》（CNAS—GL 006：2019）[6]、《化学分析测量不确定度评定》（JJF 1135—2005）[7]、《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）[8]和《食品安全国家标准 食品中阿斯巴甜和阿力甜的测定》（GB 5009.263—2016）[9]中的技术规范，对阿斯巴甜在糕点中含量的不确定度进行分析计算，找到影响检测结果的主要原因，为实验的质量控制和检测结论的准确度，提出了科学、可信的 依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇（色谱醇，国药集团化学试剂有限公司）；去离子水（实验室自制符合GB/T 6682—2008规定）；阿斯巴甜标准品（纯度99%，德国Dr.Ehrenstorfer公司）；糕点来自市场抽查随机样本。

1.2 仪器与设备

1100高效液相色谱仪（Agilent）；ATX224电子天平（岛津）；AUW120D电子天平（岛津）。

1.3 实验方法

参照《食品安全国家标准 食品中阿斯巴甜和阿力甜的测定》（GB 5009.263—2016）中焙烤食品的方法处理试样，配制标准溶液曲线。

数学模型如下式：

式中：C0为样品中阿斯巴甜的浓度，g/kg；A0为试样溶液的色谱峰高与保留时间的积分值（即峰面积）；A1为标准溶液的色谱峰高与保留时间的积分值（即峰面积）；C1为标准溶液的浓度，g/kg；m为试样质量，g；V为样品最后定容体积，mL。

2 结果与分析

2.1 不确定度的来源分析

在随机或系统影响下引入不确定度分量，就可以判断出由试样称量、标准溶液配制、定容和拟和标准曲线等所带入的不确定度[10-13]。如图1所示。

图1 不确定度来源图

2.2 标准溶液的不确定度评定

2.2.1 标准品纯度引入的不确定度

标准品的证书给出纯度及不确定度，但是在检验中有可能同时用到多个标准物质绘制工作曲线，则需要计算多个标准物质的相对标准不确定度的均方根。例如，由阿斯巴甜标准样品说明书可知其纯度大于98%，其区间的半宽度即纯度（99±1）%。属于B类不确定度，采用均匀分布，可以算出对标准品纯度所引入的标准不确定度和相对标准不确定为。

2.2.2 标准品称量引入的不确定度

标准品称量所用的天平感量为十万分之一，按照检定规程中给出的最大允许误差计算得，a=0.0005 g，根据均匀分布，不确定度为，由于标准品实际称取为0.10025 g，因此相对不确定度为u2rel=0.00029/0.10025 =2.9 ×10-3。

2.2.3 标准储备液配制引入的不确定度

玻璃器皿的不确定度主要来源是玻璃器皿的示值偏差和玻璃器皿受环境温度改变导致收缩或膨胀引起溶液体积变化。

玻璃器皿的示值偏差按照国家计量技术规范 JJG 196—2006中给出的最大允许差d以及均匀分布进行计算，不确定度为。

玻璃器皿出厂时已在20 ℃恒温下校正。计算其在室温下对溶液体积改变的不确定度，重点是要判断其在溶液配制和使用时的室温下是否有变化。如果配制和使用溶液时是在相同室温下，则不需要再考虑液体体积改变的影响。本实验中操作温度为17～23 ℃，水的膨胀系数为2.1×10-4/℃，在95%置信区间下，k=1.96，玻璃器皿体积变化的标准不确定度为。合成标准不确定度为，相对标准不确定度为。如果在实际测量中温度波动较小或溶剂膨胀系数较小，该项产生的影响相对较小可忽略。

配制阿斯巴甜标准储备液所用的是100 mL 的A级容量瓶，根据上述内容可以测算出阿斯巴甜标准储备液的相对不确定度为= 0.000588。

2.2.4 配制标准工作溶液过程中玻璃量器产生的不确定度

配制标准工作溶液过程中使用了一系列玻璃量器，需要注意的是这里使用不同的25 mL移液管。评定方法同2.2.3，结果见表1。

由表1中数据可知，配制标准工作溶液过程中玻璃量器产生的相对不确定度为u2rel(V)=0.0051。

表1 移液管和容量瓶的不确定度

2.2.5 标准溶液的不确定度分量的合成

合成2.2.1～2.2.4步骤标准溶液的配制过程中的不确定度分量，则标准溶液的相对标准不确定度=0.00778。

2.3 样品制备过程引入的不确定度

2.3.1 样品称量过程的不确定度

样品称量过程的不确定度主要来源于称量过程的变动性以及天平的准确性。天平的准确性由天平分辨力的不确定度以及天平线性的不确定度合成。检定证书提供天平线性为0.15 mg，并假设其均匀分布，其标准不确定度u3=0.15/=0.087 mg，天平的分辨率为0.1 mg，区间半宽度a=0.1/2=0.05，则u4=0.05/=0.029 mg；称量过程的变动性也可通过多次称量获得，因此称量时产生的标准不确定度为，称样量为10.0785 g，所以相对标准不确定度。

2.3.2 样品定容过程引入的不确定度

定容过程使用的容量瓶是容量为50 mL的A级容量瓶，按照标准规定，其最大允许误差d为±0.05 mL，按照2.2.3计算后，在此过程带入的相对标准不确定度为u3rel(V)=0.000661。

2.4 标准曲线拟合过程不确定度

用标准储备液配制500.0 μg/mL、250.0 μg/mL、125.0 μg/mL、50.0 μg/mL和25.0 μg/mL的5种浓度标准工作溶液，用高效液相色谱仪测定，每一浓度测定3次，数据见表2。横轴是浓度C，纵轴是峰面积S，拟合标准曲线数学模型为S=aC+b，计算线性方程的斜率为S=2279×C+6817（a=2279，b=6817），相关系数为R=0.9999。

表2 系列标准工作溶液峰面积测定结果

按（2）式（贝塞尔公式）计算S残差的标准偏差，按（3）式计算阿斯巴甜待测液的标准不确定度。

式中：C0为根据线性方程计算的待测液的质量浓度，C0=161 μg/mL；p=6，为C0的测量次数；Si为各测量结果值；Sj为线性方程计算值，Sj= 2279×Cj+6817；n为测定标准溶液的测量次数，n=15；Ci为标准溶液的质量浓度，μg/mL。

根据表2数据可以计算得u(C0)=0.393，曲线拟合的过程带入相对标准不确定度u6rel=0.00246。

2.5 重复性试验过程中引入的不确定度

根据1.3进行前处理的样品，对糕点中的阿斯巴甜重复进行了6次独立实验，检验结果分别为 0.802 g/kg、0.794 g/kg、0.832 g/kg、0.810 g/kg、 0.798 g/kg和0.803g/kg。根据贝塞尔公式（1）计算重复性引起的不确定度u(c—)，计算公式如下：

式中：c为6次重复测试值的平均值；n为测定次数，n=6；c为待测液中阿斯巴甜的浓度，g/kg。

2.6 总合成相对标准不确定度的确定

总合成相对标准不确定度为u0rel== 0.0207。

2.7 扩展标准不确定度

置信水平p=95%，包含因子k=2，则合成标准不确定度= 0.0207 × 0.806 = 0.0167。

相对扩展不确定度U=K×uc=0.033。

2.8 测量不确定度报告

用GB 5009.263—2016方法重复6次测定糕点中阿斯巴甜平均含量为（0.806±0.033）g/kg，k=2。

3 结论

本文主要从配制标准储备溶液、配制标准工作溶液、拟合标准曲线、试样称量、试样定容、重复性测试6个方面对糕点中阿斯巴甜测定过程中的不确定度进行分析，根据GB 5009.263—2016检测糕点中阿斯巴甜时，应注意，测量重复性、试样称量和定容过程、标准溶液的配制过程和标准曲线的拟合，从而计算不确定度以确保检测结论的准确性。