不同厂家非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒比对

许秀琼，刘 劼，吴立炀，叶 健，查云峰，王福广，孙柏林，卢受昇

（广东省动物疫病预防控制中心，广东省动物卫生检疫所，广东广州 510230）

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，临床上以高热、网状内皮系统出血和高死亡率为特征，严重危害养猪业发展。世界动物卫生组织（WOAH）将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病[1]。2018 年8 月我国首次报道ASF 疫情[2]。目前该病尚缺乏有效的预防疫苗和针对性治疗药物，因此精准剔除阳性动物尤为重要。荧光PCR 检测方法具有敏感、快速、灵敏等优点，检出下限为6 个质粒拷贝或0.1～1.0 TCID50/mL[3-4]，是实现精准剔除的最佳方法。但近年新出现的ASFV变异毒株具有排毒量低、不易检测等特点[5]，这对试剂盒的敏感性和特异性提出了更高要求。

本试验选取了6 个厂家的ASFV 荧光PCR 检测试剂盒，参照OIE《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2018 年版）[3]1.1.6 章推荐的程序要求，对其特异性、敏感性和重复性进行了比较分析，以期了解各个试剂盒的性能特点及差异。

1 材料与方法

1.1 样品

ASF 阳性样品，包括血清、全血及组织；ASF阴性样品，包括组织和血清；ASFV 核酸标准物质和特异性对照，包括疫苗和抗原。ASF阴、阳性样品，由市级动物疫病预防控制中心实验室初步检测，再由广东省动物疫病预防控制中心复检确定，详见表1。

表1 样品类型、数量及来源 单位：份

1.2 设备与试剂

本次试验使用的荧光PCR 仪为罗氏LC480，所有仪器均已通过计量校准；试剂盒为6 个厂家的ASFV 荧光PCR 检测试剂盒，分别用A、B、C、D、E、F 表示，每个厂家产品各检测2 个批次；DNA提取试剂盒为广州达安基因股份有限公司产品。

1.3 验证试验

1.3.1 DNA 提取及PCR 检测 DNA 提取按照达安基因核酸提取纯化试剂盒（磁珠法）说明书进行，荧光PCR 检测按照6 个厂家相应的试剂盒说明书进行。

1.3.2 分析特异性（analytical specificity，ASp）使用72 份ASF 阳性样品、6 份ASF 阴性组织样品、2 份ASF 阴性血清样品，评价检测试剂盒的包含性。使用2 份猪繁殖与呼吸综合征疫苗、2 份猪瘟兔化弱毒株疫苗、2 份口蹄疫（A、O、Asia I）抗原混合物、2 份伪狂犬病毒核酸标准物质，评价试剂盒的排他性。结合统计学中的诊断特异性（diagnostic specificity，DSp）、诊断敏感性（diagnostic sensitivity，DSe）、Youden 指数、受试者工作特征曲线（receiver operating charaCteristic curve，ROC 曲线）等统计学方法[6]，综合评价试剂盒的分析特异性。计算公式[6]：

式中a为真阳性数，b为假阳性数，c为真阴性数，d为假阴性数。

1.3.3 分析敏感性（analytical sensitivity，ASe）使用终点稀释法，将ASFV 核酸标准物质进行10倍梯度稀释，得到稀释度依次为100～10-7的8 份样品，对每份样品进行3 次重复检测，以确定试剂盒的最低检出限（LOD）。绘制标准曲线，计算核酸含量（copies/μL），综合评价试剂盒的分析敏感性。

1.3.4 重复性（repeatability）选取稀释度为10-1和10-3的ASFV 核酸标准物质，由两名实验人员使用各试剂盒的批内及批间产品，对每个稀释度样品进行5 次重复检验，根据检测结果计算变异系数（CV），评价试剂盒的重复性。

1.3.5 统计学分析 使用Microsoft Excel 和SPSS 26.00，对上述结果进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 分析特异性

样品盘包括88 份样品，其中ASF 阳性样品72份、ASF阴性样品16份。诊断特异性结果显示，B、C、D、E、F 试剂盒的特异性均达到了100%，仅有A 试剂盒为87.50%；诊断敏感性从高到低依次为E ＞A/B ＞F ＞C/D；Youden 指数从高到低依次为E ＞B ＞F ＞C/D ＞A。具体结果见表2。

表2 各试剂盒分析特异性结果

利用SPSS 软件绘制ROC 曲线并计算ROC曲线下区域面积（AUC）。当AUC ＞0.9 时，代表检测结果准确性高，AUC 越大，试剂盒的准确性越高[6]。如图1 和表3 所示：有5 个试剂盒的AUC ＞0.9，说明大部分受测试剂盒准确性较高，AUC 从大到小依次为E ＞B ＞F ＞C/D ＞A，与Youden 指数结果一致。

表3 各试剂盒AUC 结果

2.2 分析敏感性

对8 个稀释度（100～10-7）的ASFV 核酸标准物质，分别进行3 次重复检验，根据结果绘制标准曲线。结果（图2）显示，受测试剂盒A、B、C、D、E、F 的标准曲线斜率分别为-3.57、-3.67、-3.33、-3.63、-3.36、-3.63，线性回归系数分别为0.993 0、0.999 2、0.985 0、0.999 6、0.998 0、0.999 2，均较理想。A、B、E、F 的LOD 均为10-1～100copies/μL，C 为100～101copies/μL，D 为101～102copies/μL，由高到低依次为A/B/E/F ＞C ＞D，说明受测试剂盒的LOD 均能达到10-1～102copies/μL。

2.3 重复性比较

对10-1和10-3两种稀释度的ASFV 核酸标准物质进行检测发现（表4），检测高浓度样品时，试剂盒的重复性较好，批内及批间的CV 均控制在1.5%以内。在检测低浓度样品时，试剂盒的重复性较差，因此仅对检出率达到80%以上的试剂盒进行CV 分析，结果批内CV 为2.25%～6.12%，批间CV 为2.93%和4.93%，批内、批间差异均较大。

3 讨论

ASF 疫情发生后，养猪从业者的生物安全意识普遍增强，生物安全措施不断得到改进和完善。但由于病毒污染面广，且田间毒株不断发生变异，使得ASF 流行情况复杂多变[1]，尤其是弱毒株的感染，隐蔽性强，严重危害养猪生产。在缺乏有效疫苗和针对性治疗手段时，精准剔除阳性动物十分重要，而实现精准剔除的前提是应用快速、准确的诊断方法，而具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点的荧光PCR 检测技术是最佳选择。该技术被认为是迄今为止最灵敏可靠的方法之一[7]，因此对荧光PCR 试剂盒的性能进行综合评价就显得尤为重要。本试验通过对6 个厂家ASFV 荧光PCR 检测试剂盒的敏感性、特异性、重复性等指标进行比较，综合评估了各试剂盒的性能，结果发现各试剂盒的的特异性、敏感性表现均较好，可满足基本检测需求，但重复性差异较大。

特异性方面，本试验样品盘设置包括临床组织、血清、全血以及疫苗、抗原等多种类型样品，对试剂盒的包含性和排他性开展评价，以期为试剂盒适用性提供更加真实可靠的数据[8-9]。综合评价结果显示，部分试剂盒对临床样品漏检的比例较大，且出现假阳性情况。原因可能有两点：一是制造商选取的参考毒株或供验证的备选毒株代表性不强，与当前流行毒株差异较大；二是反应条件优化程度不够，或者引物探针特异性不强，影响了试剂盒的特异性。ASFV 基因组易发生变异，且各国流行情况不同[10]，因此制造商应结合使用地的实际情况进行试剂盒的设计和生产，避免影响其特异性。

敏感性方面，荧光PCR 的线性检测范围为0～1011copies/mL[11]，受测试剂盒总体符合检测线性范围要求，但试剂盒间的敏感性差异可达百倍。影响敏感性的因素可能有以下几种：（1）Taq酶的选取。热启动Taq酶、高保真酶等可以有效提高扩增效率。（2）引物的优化程度。应尽可能减少引物二聚体对反应体系的影响。（3）反应条件优化程度。循环数、温度尽可能达到最优反应条件。（4）Mg2+浓度以及DNA的完整性和合适的模板浓度等。

重复性方面，当样品的稀释倍数越高，Ct 值越接近临界值时，试剂盒的重复性越低。对稀释倍数高，Ct 值接近临界值的样品，建议增加检测次数，提高结果准确性。试剂盒在检测高浓度样品时，重复性均较好，且批内重复性较批间重复性好。重复性是验证试剂盒质量的重要手段，也是试剂盒在实际应用中的价值体现[12]。检测发现，试剂盒的重复性与敏感性关系密切，敏感性较差的试剂盒，在检测低浓度样品时，重复性也较差。

受测的部分试剂盒没有设置内参，可能会使检测结果的差异变大[13]。另外，部分试剂盒采用病毒的核酸片段作为阳性质控品，其质量不稳定，使用时易降解，会影响试验的准确性，且该质控品未与样品同步进行核酸提取，缺乏对核酸提取环节的有效评估，装甲病毒（假病毒）质控品的研究有望弥补这一缺陷[9]。

本试验评价了6 种ASFV 商品化荧光PCR检测试剂盒，但仍有需进一步完善的地方，如增加对人工攻毒动物的检测，因为不同感染时期的检测结果，对试剂盒诊断适用性方面的评估也非常具有参考价值[9]。各个实验室可根据自身用途和实际情况，在保证试剂盒重复性的前提下，灵活选择特异性和敏感性适合的试剂盒。本研究使用的评价方法对其他病毒荧光PCR 检测试剂盒的评价也具有参考意义。