HPLC-MS/MS 内标法测定液体乳中的三聚氰胺

周慧敏

（大连市检验检测认证技术服务中心，辽宁大连 116630）

三聚氰胺，简称三胺，学名三氨三嗪，是一种氮杂环有机化工原料，广泛用于木材、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革、电气和医药等行业。由于具有毒性，不可用于食品加工或食品添加物[1]。三聚氰胺进入人体后难以代谢和排出，过量摄入三聚氰胺会促使体内形成结石，从而诱发泌尿系统疾病，甚至导致肾衰竭和死亡[2]。2008 年三聚氰胺事件后，三聚氰胺的检测对乳品企业非常重要，是乳品企业质量控制部门日常工作的重要监测项目，也是各级市场监督管理部门重点监管项目[3]。婴儿配方食品中三聚氰胺的限量值为1 mg/kg，其他食品中三聚氰胺的限量值为2.5 mg/kg，高于上述限量的食品一律不得销售。

目前三聚氰胺检测一般采用国家推荐标准《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》（GB/T 22388—2008）[4]， 该 标 准 包 括 高 效 液 相 色 谱 法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）、液相色谱-质谱/质谱法（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）和气相色谱-质谱联 用 法（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）。GB/T 22388—2008 中HPLC、LC-MS/MS前处理均采用阳离子交换固相萃取柱净化，基质加标外标法定量，方法操作烦琐，检测成本高。GC-MS（GC-MS/MS）采用阳离子交换固相萃取柱净化后，进行硅烷化衍生，外标法定量，前处理方法更加复杂。目前有文献报道使用HPLC-外标法进行定量分析，测定食品中含乳饮料的三聚氰胺非法添加剂的含量，但HPLC 方法相对于LC-MS/MS 灵敏度偏低，对低含量样品不适宜[5]。

本方法采用LC-MS/MS，以三氯乙酸和甲醇作为萃取试剂，经亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀蛋白后，用三聚氰胺13C3为内标进行测定。由于液体乳蛋白含量高，前处理过程中用蛋白沉淀剂取代了阳离子交换固相萃取柱净化，简化了实验步骤，用三聚氰胺13C3为内标定量减少了基质效应对实验结果的影响，与《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》（GB/T 22388—2008）相比，本方法更为简便，准确度更高。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

Agilent 6460 液相质谱联用仪（美国Agilent 公司）；XW280A 旋涡混合器（上海精科实业有限公司）；Z 32HK 型高速离心机（德国HERMLE 公司）。

1.2 材料与试剂

三氯乙酸（分析纯，天津科密欧公司）；亚铁氰化钾（分析纯，天津科密欧公司）；乙酸锌（分析纯，天津科密欧公司）；乙酸（分析纯，天津科密欧公司）；乙酸铵（分析纯，天津科密欧公司）；乙腈（色谱纯，天津科密欧公司）；三聚氰胺（标准品，LGC 公司）；三聚氰胺13C3（标准品，LGC 公司）；微孔滤膜（13 mm 0.22 μm GHP，美国Waters 公司）。

三氯乙酸溶液：将10 g 三氯乙酸溶于1 000 mL水中，配制成1%的三氯乙酸溶液。

亚铁氰化钾溶液：称取106 g 亚铁氰化钾，用水定容至1 000 mL，配制成92 g/L 的亚铁氰化钾溶液。

乙酸锌溶液：称取220 g 乙酸锌酸，用水定容至1 000 mL，配制成183 g/L 的乙酸锌溶液。

三聚氰胺标准储备液：称取50 mg 三聚氰胺于50 mL 容量瓶中，50% 甲醇定容至刻度，得1 000 mg/L 的三聚氰胺标准溶液。

三聚氰胺13C3标准储备液：称取50 mg 三聚氰胺13C3于50 mL 容量瓶中，50%甲醇定容至刻度，得1 000 mg/L 的三聚氰胺13C3标准储备液，再用50%甲醇稀释得到10 mg/L 的三聚氰胺13C3标准中间液。

标准工作液：三聚氰胺、三聚氰胺13C3标准储备液用50%甲醇溶液逐级稀释得到2.5 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、50.0 ng/mL 和100.0 ng/mL的三聚氰胺以及20 ng/mL 的三聚氰胺13C3标准工作液。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理

称取样品约5 g 置于50 mL 带刻度离心管中，分别加入10 mg/L 的三聚氰胺13C340.0 μL，旋涡混合使内标完全溶于样品，再向样品中分别加入7 mL三氯乙酸溶液、0.5 mL 亚铁氰化钾溶液、0.5 mL 乙酸锌溶液，用甲醇溶液定容至20 mL，旋涡混合2 min，10 000 r/min 离 心5 min， 过0.22 μm 滤 膜后收集于进样瓶中，待上液质联用仪检测，进样量1 µL。

1.3.2 配制标准曲线

分 别 取2.5 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、50.0 ng/mL 和100.0 ng/mL 的三聚氰胺以及20 ng/mL的三聚氰胺13C3标准工作液，直接进样，进样量1 µL。

1.3.3 样品测定

（1）色谱条件。色谱柱：Agilent Rx-SiL 4.6 mm×150 mm×5 μm；流动相乙酸铵溶液配制：准确称取0.385 g 乙酸铵，加入1 mL 乙酸，加水定容至500 mL；流动相：乙腈∶乙酸铵溶液=50 ∶50；流速：0.4 mL/min；柱温：40 ℃。

（2）质谱条件。电离方式：ESI+；监测模式：MRM；离子源温度：350 ℃；离子喷雾电压：4 000V；各组分定性定量离子对等参数见表1。

表1 目标组分质谱检测参数

2 结果与分析

2.1 仪器条件优化

先将目标组分配制成1 000 ng/mL 的溶液，利用针泵进样，找到母离子和子离子以确定MRM 离子对，优化碰撞能，结果见表1。确定最优质谱检测条件后进一步优化液相色谱条件，采用安捷伦Rx-SiL （4.6 mm×150 mm, 5 μm）色谱柱，流动相为乙腈∶乙酸铵溶液=50 ∶50，流速为0.4 mL/min，柱温为40 ℃。同时，选择三聚氰胺13C3作为内标（添加浓度为20 ng/mL），能够满足大多数样品的检测。

2.2 标准曲线及定量限

2.2.1 标准曲线

以目标物测定浓度为横坐标，目标物与对应同位素内标峰面积比为纵坐标，绘制三聚氰胺标准曲线，在2.5 ～100.0 ng/mL 线性关系良好，回归方程为y=0.998 266x+0.041 23，相关系数r为0.999 3，符合检验对标准曲线的要求。

2.2.2 方法定量限

选一空白样品，按1.3.1 实验步骤做加标回收实验，添加浓度从0.1 mg/kg 逐渐稀释，当添加水平至0.01 mg/kg 时，回收率均值为82.8%，相对标准偏差（RSD）为5.6%，满足实验要求，再降低添加浓度得到回收率均值，相对标准偏差（RSD）不符合实验要求。因此，确定0.01 mg/kg 为定量限。

2.3 回收率实验

分别向空白样本中添加标准工作液、同位素内标工作液，按照1.3.1 步骤处理并检测。添加水平为0.01 mg/kg、0.03 mg/kg、0.10 mg/kg 3 个水平，每个浓度6 份平行样本，检测结果见表2。方法回收率为82.8%～102.3%，相对标准偏差为3.2%～5.6%，回收率和精密度良好，符合检测方法要求，适合液体乳中三聚氰胺的检测。

表2 试样回收率实验结果

2.4 讨论

2.4.1 沉淀剂的选择

亚铁氰化钾和乙酸锌是实验室常用的蛋白沉淀剂，在多个检测标准中都有应用，价格便宜容易获得，是常用的前处理手段，净化去除效果良好。在市场上采集20 份液体乳样本按1.3.1 实验步骤处理并检测，在质谱上均未发现有明显干扰组分，因此本方法选择亚铁氰化钾和乙酸锌作为沉淀剂进行沉淀净化。

2.4.2 与标准方法对比

为比较本方法与国家推荐标准《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》（GB/T 22388—2008）[4]的检测结果的一致性，设计实验如下。

向空白样本中添加标液，添加水平为0.04 mg/kg，分别采用GB/T 22388—2008 第二法液相色谱-质谱/质谱法[4]和本方法进行检测，每种方法测定6份平行样本。GB/T 22388—2008 检测结果平均值为0.035 mg/kg，本方法检测结果平均值为0.037 mg/kg。实验表明，两种方法测定的结果无显著性差异，本方法适合液体乳中三聚氰胺的检测。

3 结论

我国乳制品产量中，液体乳产量占比较大，达93.32%，其次为乳粉，占比达3.87%。乳制品检测在各级抽查中占比较高，液体乳中的三聚氰胺的检测更是监管的重点。因此，寻找更加准确、快捷的液体乳中三聚氰胺检测方法对于节省成本、提高工作效率有着重要的意义。

本方法以三氯乙酸和甲醇作为萃取试剂，经亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀蛋白，通过高效液相色谱-串联质谱仪，采用电喷雾正离子化模式（ESI+）和多反应检测（MRM），以三聚氰胺13C3内标法测定液体乳中的三聚氰胺。结果表明，该方法可准确测定液体乳中的三聚氰胺含量，且有很好的线性关系，相关系数大于0.99，定量限为0.01 mg/kg，加标回收率在82.8%～102.3%，从而确认本方法可准确、快捷测定液体乳中的三聚氰胺。