柱前衍生-高效液相色谱法测定食品中的亚硝酸盐

袁 圆，崔晓娇，周金沙，尹芳平，黄 亮，夏炜杰

（长沙市食品药品检验所&国家酒类产品质量检验检测中心，湖南长沙 410000）

目前，有关亚硝酸盐的检测方法主要有离子色谱法[3-4]、分光光度法[5-6]、高效液相色谱法、气相色谱法、荧光法、化学传感器法和催化光度法等。现行国标《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》（GB 5009.33—2016）采用的是离子色谱法和分光光度法，但离子色谱法受高盐食品中氯离子干扰较大，分光光度法则受色素的干扰较大。陈文生等[7]采用高效液相色谱法在204 nm 波长下测定亚硝酸根离子，此法前处理较简单，但分析的基质比较单一，且低波长下检测可能存在干扰。目前，能同时不受色素、高盐食品中氯离子影响且不受低波长干扰的液相色谱法未见报道。本研究参照《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》（GB 5009.33—2016），利用亚硝酸根离子与对氨基苯磺酸和盐酸萘乙二胺衍生显色生成紫红色的偶氮化合物（目标物）进行柱前衍生，采用C18色谱柱对目标物进行分离，在高波长（480 nm）下进行检测，可为含高盐和色素等复杂基质中亚硝酸盐含量的测定提供技术支持和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白酒、威士忌、液体奶、腌肉和酱腌菜为市售样品；阳性白酒、威士忌、液体奶均为实验室自制。

肉制品中亚硝酸盐质控样品（批号为CFAPAQC202107B-2，大连中食国实检测技术有限公司）；亚硝酸钠标准品（200.0 mg/L）、柠檬黄（纯度96.2%）、新红（纯度88.9%）、苋菜红（纯度95.3%）、胭脂红（纯度89.8%）、日落黄（纯度93.7%）、 亮 蓝（ 纯 度87.6%）、 赤 藓 红（ 纯度86.0%）、诱惑红（纯度97.9%）和酸性红（纯度93.2%），均为北京曼哈格生物科技有限公司；乙酸铵、盐酸萘乙二胺、乙酸锌硼砂、对氨基苯磺酸和亚铁氰化钾，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；甲醇，色谱纯，德国默克公司；实验用水，法国Millipore 公司纯水仪制备。

1.2 仪器与设备

Agilent 1260 高效液相色谱仪（配二极管阵列检测器，美国安捷伦有限公司）；UV-2450 紫外可见分光光度计（岛津国际贸易上海有限公司）；EOFO型数显型多管式旋涡混合器（美国Talboys 公司）；Milli-Q Direct8 超纯水仪（美国密理博公司）；超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液配制

吸取2.50 mL 亚硝酸钠标准溶液置于100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，配制成5.0 mg/L 亚硝酸钠标准使用液，吸取适量标准使用液，分别置于50 mL 带塞比色管中，分别加入2 mL 的4 g/L 对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置5 min 后各加入1 mL 2 g/L 盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15 min 配成质量浓度为0.015 ～0.250 mg/L 的系列工作溶液。

1.3.2 样品处理

称取威士忌、白酒10 g（精确到0.000 1 g）于50 mL 比色管中，加入30 mL 水，混匀备用；液体奶称取10 g，酱腌菜和腌肉称取2 g（精确到0.000 1 g）于150 mL 锥形瓶中，加入80 mL 水，超声提取30 min。在75 ℃水浴中加热5 min，取出放置至室温，定量转移至100 mL 容量瓶中，分别加入2.5 mL 106 g/L 亚铁氰化钾溶液、2.5 mL 的220 g/L 乙酸锌溶液，加水定容至刻度后摇匀，过滤，弃掉初滤液，取40 mL 滤液于50 mL 比色管中，分别加入2 mL 的4 g/L 对氨基苯磺酸溶液，混匀备用；各备用液中分别加入2 mL 的4 g/L 对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置5 min 后各加入1 mL 的2 g/L 盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15 min，0.2 μm 亲水PTFE微孔滤膜过滤，待高效液相色谱分析测定。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：Agilent 5 TC-C18(2)色谱柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm）；流动相：甲醇-0.02 mol/L 乙酸铵（35 ∶65，V∶V）；流速：1 mL/min；柱温：40 ℃；检测波长：480 nm；进样量：50 μL。

2 结果与分析

2.1 DAD 波长的选择

为选取检测的最佳波长，用二极管阵列检测器对目标物进行全波长扫描，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，如图1 所示，目标物的最大吸收波长为480 nm，因此选择检测波长为480 nm。

图1 目标物的光谱图

2.2 流动相的优化

（1）色素干扰。由于色素的紫外吸收波长与亚硝酸盐显色后的目标物类似，在紫外分光光度法中对亚硝酸盐的测定有干扰。因此，为了消除色素在液相色谱法中产生的干扰，优化色谱条件时需要将色素一起优化，9 种食品中常见色素分别为柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮蓝、赤藓红、诱惑红和酸性红。

（2）流动相体系。分别用甲醇-水、甲醇-0.1%乙酸、甲醇-0.01 mol/L 乙酸铵和甲醇-0.02 mol/L 乙酸铵4 种体系的流动相分析测定目标物与9 种色素的混合标准溶液。结果表明，甲醇-0.02 mol/L 乙酸铵流动相体系下目标物与9 种色素的分离效果最好，因此甲醇-0.02 mol/L 乙酸铵体系被选为流动相。调节甲醇的比例，当甲醇-0.02 mol/L 乙酸铵的体积比为35 ∶65 时，目标物与9 种色素可以有效分离，且响应最好，因此确定甲醇-0.02 mol/L 乙酸铵体积比为35 ∶65。

（3）不同pH 的乙酸铵溶液对出峰的影响。用冰乙酸调节乙酸铵溶液pH 为3、5 和7 作对比，由图2 可知，pH=7 时，目标物与9 种色素分离效果最佳，保留时间最为适宜，因此选择pH=7 的0.02 mol/L 乙酸铵作为流动相。

图2 不同pH 乙酸铵溶液中目标物的色谱图

2.3 干扰实验

考查了与NO2-可能共存的9 种阴离子分别为和F-和与显色后的目标物紫外吸收类似的9 种色素（柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮蓝、赤藓红、诱惑红和酸性红）对本研究的干扰，由于9 种阴离子不能参与衍生反应，因此对目标物的分析不产生干扰，9 种色素的干扰实验中，亮蓝、次藓红和酸性红不出峰，诱惑红、日落黄和胭脂红能与目标物完全分离，因此9 种色素对目标物的响应和分离完全无影响，此方法选择性较好，适用于分析实际样品中的亚硝酸盐含量。

2.4 线性范围、检出限和定量限

分别配制质量浓度为0.015 mg/L、0.030 mg/L、0.060 mg/L、0.100 mg/L、0.150 mg/L 和0.250 mg/L的目标物标准工作溶液。在波长480 nm 下进行高效液相色谱分析，以质量浓度（X，mg/L）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，得出线性回归方程为Y=968.87X+0.11，r2=0.999 9，在0.015 ～0.250 mg/L，目标物的质量浓度与峰面积呈现良好的线性关系。以信噪比（S/N≥3）计算方法得出检出限，以信噪比（S/N≥10）计算方法得出定量限，威士忌、白酒、液体奶、酱腌菜和腌肉的检出限分别为0.023 mg/kg、0.023 mg/kg、0.057 mg/kg、0.28 mg/kg 和0.28 mg/kg，定量限分别为0.075 mg/kg、0.075 mg/kg、0.19 mg/kg、0.94 mg/kg 和0.94 mg/kg，结果满足检测的要求。

2.5 精密度及回收率

在本方法条件下，采用空白样品中添加标准溶液的方法，分别进行高、中、低3 个水平浓度加标，进行6 次重复实验，测得平均回收率及相对标准偏差。每4 h 进高效液相色谱测定一次，计算方法的日内精密度，以RSD 表示；每24 h 进高效液相色谱测定一次，连续测定3 d，计算方法的日间精密度，以RSD表示。由表1 可知，回收率范围为83.3%～96.0%（n=6），精密度范围为1.1%～5.3%；日内精密度范围为1.0%～3.8%（n=6）；日间精密度范围为2.3%～7.8%（n=3），表明本方法可靠，符合检测要求。

表1 方法的平均回收率和精密度

2.6 分光光度法与柱前衍生-高效液相色谱法的比对

采用GB 5009.33—2016 中的第二法分光光度法和本方法建立的高效液相色谱法同时测定肉制品中亚硝酸盐质控样品、酱腌菜、腌肉和自制阳性威士忌、白酒、液体奶中亚硝酸盐含量，每个样品平行测定3 次，两种方法测定质控样的结果（取3 次测定平均值）见表2。由表2 可知，肉制品中亚硝酸盐质控样品亚硝酸盐（以亚硝酸钠计）的指定值为1.89 mg/kg，标准差为0.34 mg/kg，两种方法|z|值均小于2，结果均为满意。两种方法测得其他样品中亚硝酸盐含量结果RSD 在5%以内，无显著性差异，说明高效液相色谱法测定亚硝酸盐含量准确可靠。

表2 两种方法测定质控样中亚硝酸盐结果

3 结论与讨论

本研究建立了柱前衍生-高效液相色谱法检测食品中亚硝酸盐的方法。测定实际样品和质控样品中亚硝酸盐含量的结果比对，验证了该方法的适用性与准确性。该方法能够有效消除氯离子等其他阴离子和色素对检测的干扰，建立的分析方法灵敏度、准确度、精密度和回收率好，适用于食品中亚硝酸盐的检测。