Central-Composite Design 响应面实验设计用于金盏菊提取工艺的研究

时 宇，成永燕，刘芷萱，刘睿姿，孙 政，迟梦辰

（山东第一医科大学（山东省医学科学院），齐鲁制药集团有限公司，山东济南 250000）

金盏菊为来源于菊科盏菊属植物金盏菊的干燥全草，具有清热解毒、凉血调经之功效[1-2]。现代药理学研究表明，金盏菊具有良好的抗炎、抗菌及抗氧化作用，被广泛用于食品、化妆品及医疗领域。金盏菊中主要包含黄酮类、皂苷类及挥发油等多种化学成分[3]。有效成分作为中药发挥作用的物质基础，如何最大限度地提取药材中的有效成分是充分利用中药的首要前提。因而，其提取工艺的研究成为中药制剂研究的重要内容之一。

在提取工艺的优化过程中，需要考察不同因素、不同水平对有效成分提取效率的影响，该过程往往是涉及多因素、多水平、多目标的复杂过程，而目前应用较多的优化方法大多采用单因素实验设计或正交实验设计，不能全面、综合地反映提取工艺的优劣。中心组合设计（Central Composite Design，CCD）作为效响应面实验设计的一种，通过建立因素与响应值之间的数学拟合方程，能够结合统计学分析寻求最佳工艺参数。近年来，该方法被广泛用于药材的提取工艺及处方设计的优化研究中[4-5]。

本实验拟采用中心组合设计，以金盏菊中有效成分总黄酮及浸出物为考察指标，对其提取工艺进行优化，以期确定金盏花的最佳提取工艺，为金盏菊开发和利用提供实验方法和理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

电子天平[BT25S，赛多利斯仪器（北京）有限公司]；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；紫外可见光分光度计（UV-8000A，上海元析仪器有限公司）。

金盏菊药材购于漱玉平民大药房，经鉴定为菊科植物金盏菊的全草；芦丁对照品，购于中国食品药品检定研究院（批号100080-202012）；无水乙醇、三氯化铝等所用试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 金盏菊提取工艺条件CCD 实验设计

根据中心组合响应面实验设计的原理，利用Design-Expert®软件以总黄酮得率及浸膏得率为响应值，以药材与提取溶剂的比例（料液比）、乙醇浓度、提取温度为自变量，设计3 因素3 水平的响应面试验，对金盏菊的提取工艺进行优化。金盏菊提取工艺条件CCD 实验设计的因素水平见表1。

表1 CCD 实验设计因素水平表

1.2.2 供试品溶液配制

精密称取金盏菊药材粉末5.0 g，按照表2 中实验设计安排分别加入不同浓度的乙醇溶液，回流提取2 次，滤过后合并两次滤液定容至250 mL 容量瓶中，作为供试品溶液备用。

1.2.3 浸膏得率的测定

精密量取1.2.2 项下供试品溶液10.0 mL 置于已知质量（M1）的蒸发皿中，水浴加热蒸干，105 ℃烘箱中干燥4 h 直至恒重（M2），则浸出物的质量为M2-M1。因此，

1.2.4 总黄酮含量的测定

（1）对照品溶液的制备。精密称取芦丁对照品4.04 mg 置于10 mL 容量瓶中，乙醇溶解并稀释至刻度，制备成浓度为0.404 mg/mL 的芦丁对照品溶液。

（2）标准曲线的制备。分别精密量取（1）项中芦丁对照品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL 和1.0 mL 置于10 mL 容量瓶中，加入1%三氯化铝乙醇溶液5.0 mL，乙醇定容至刻度。随后置于50 ℃水浴中显色10 min[6]。以乙醇作为空白，在200 ～800 nm波长下进行光谱扫描，确定最大吸收波长为418 nm。在418 nm 波长下测定吸光度，以吸光度值为纵坐标，芦丁浓度(C)为横坐标绘制标准曲线。

（3）供试品溶液的测定。精密量取1.2.2 项下供试品溶液5.0 mL，加入1%三氯化铝乙醇溶液5.0 mL，50 ℃水浴中显色10 min。以乙醇作为空白，于418 nm 波长下测定吸光度，根据标准曲线计算总黄酮含量。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

经紫外分光光度计测定芦丁的标准曲线回归方程为A=23.418C+0.017 6(R=0.999 7)。结果表明，芦丁在8.08 ～40.40 μg/mL 线性关系良好。

2.2 精密度、稳定性及重复性实验

精密移取芦丁对照品溶液0.5 mL 于容量瓶中，按1.2.3（2）项下方法进行操作，测定其吸光度值，连续测定6 次，计算RSD 值为0.82%，表明仪器精密度良好。将上述溶液每隔15 min 测定其吸光度考察稳定性，计算RSD 值为1.79%，表明该显色反应在2 h 内稳定。取同一批次样品6 份，按上述方法进行重复性实验，计算RSD 值为1.31%，表明方法重复性良好。

2.3 加样回收率实验

取已知黄酮含量的金盏菊粉末6 份，每份0.5 g，精密称定，加入芦丁对照品2.5 mg，按照供试品溶液制备方法及显色方法操作，测定总黄酮含量，计算加样回收率，结果表明平均回收率为96.5%，RSD为2.35%。

2.4 最佳提取工艺条件的确定

根据Design expert 软件所安排的实验，测定每个实验组的总黄酮含量及浸膏得率，结果见表2。

表2 CCD 实验设计方案及结果安排表

将所得的实验结果进行方差分析并拟合数学模型，结果见表3。

表3 响应值模型方程拟合结果

由回归方程模型的R2值及P值可知，二项式方程模型的拟合度和可信度良好，实验误差小。以总黄酮含量为考察指标时，其方程为：Y1=0.672 1+0.038 0X1+0.18 10X2+0.052 0X3+0.010 0X1X2+0.007 5X1X3+0.042 5X2X3-0.026 2X12-0.051 2X22+0.003 8X32（R2=0.882 1）。以浸出物得率为考察指标时，其回归方程为：Y2=4.52+0.363 0X1+0.181 0X2+0.101 0X3+0.240 0X1X2+0.012 5X1X3-0.087 5X2X3+故可用上述模型方程分析和预测金盏菊的提取工艺。

根据所拟合的二项式方程，绘制各考察因素对总黄酮和浸膏得率的三维效应曲面图，结果见图1、图2。由图1 可知，随乙醇浓度的增加，总黄酮含量呈显著增加趋势，而料液比及提取时间对其影响不大，曲面上升趋势较为平缓，这可能与黄酮在高浓度乙醇中溶解度较大有关，同时因为金盏花质地较为疏松，提取溶剂容易渗透到药材内部，会更快达到动态平衡，故料液比及提取时间对总黄酮的提取影响不大。

图1 料液比、乙醇浓度及提取时间对金盏菊总黄酮提取率影响的三维效应曲面图

图2 料液比、乙醇浓度及提取时间对金盏菊浸膏得率影响的三维效应曲面图

由图2 可知，乙醇浓度及料液比对浸膏得率的影响呈现马鞍状分布，呈现出先增加后降低的趋势。

由预先设定的限定条件，即希望总黄酮含量及浸膏得率保持最大浸出量，分析料液比、乙醇浓度及提取时间对金盏菊提取工艺的影响。由Design expert软件确定金盏菊的最优提取工艺条件为药材与溶剂的比例为1 ∶12，乙醇浓度为68%，提取时间为1.8 h，共提取两次。在此条件下，总黄酮含量和浸膏得率的预测值分别为0.86%和5.16%。

2.5 验证实验

在最优条件下进行3 次平行实验以检验CCD 实验设计的可靠性，所得到的金盏菊总黄酮含量和浸膏得率分别为0.83%和5.12%，与预测值接近，说明预测模型具有良好的可靠性。

3 结论

中心组合响应面实验设计能够更全面地表征各工艺参数对实验结果的影响，尤其是适合于多因素连续变量对响应值的影响[7]。在本实验中，利用CCD响应面实验设计，将总黄酮含量及浸膏得率作为响应值，将其限定为“最大值”进行优化，通过数学模型拟合获得最优提取工艺条件，能够克服正交实验及均匀实验设计单一线性模型的不足。实验结果表明，金盏花最佳提取工艺条件为药材∶溶剂（1∶12），乙醇浓度68%，提取时间1.8 h，提取两次，此条件下总黄酮含量和浸膏得率的预测值分别为0.86%和5.16%。该最佳工艺能够较大程度提高金盏菊中指标成分的提取效率，为其进一步开发利用及产品深加工提供理论基础及实践依据。