运动通过上调mGluR2/3表达抑制帕金森病模型大鼠纹状体中等多棘神经元异常电活动

陈平 耿小飞 刘晓莉 乔德才

1 北京师范大学体育与运动学院（北京100875）

2 吉首大学体育科学学院（湖南吉首416000）

3 河北民族师范学院体育学院（河北承德067000）

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是仅次于老年性痴呆的第二常见老年神经退行性疾病，主要表现是中枢性运动控制功能异常[1]。运动疗法作为一种简单易行且无副作用的非药物疗法，对PD 患者病情及症状缓解有一定作用，但运动防治PD 的神经机制尚不够明确[2]。本实验室前期围绕运动对神经毒素6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）诱导的偏侧PD 模型大鼠皮层-纹状体突触可塑性的研究发现，多巴胺（dopamine，DA）耗竭导致PD 模型大鼠纹状体中等多棘神经元（medium spiny neurons，MSNs）树突棘脱落与运动功能障碍出现具有相关性，运动干预可使PD 模型大鼠纹状体MSNs树突棘密度显著增加，并伴随着运动功能障碍显著改善[3]。随后又采用逆行神经示踪的方法，分别用荧光标记D1-MSNs 和D2-MSNs，发现PD 模型大鼠纹状体D2-MSNs 树突棘密度选择性丢失；运动干预可使PD 模型大鼠纹状体D2-MSNs 树突棘丢失显著逆转[4]。研究表明，代谢型谷氨酸受体2/3（metabotropic glutamate receptor 2/3，mGluR2/3）定位于皮层-纹状体突触前末梢，激活或者上调mGluR2/3能抑制电压依赖型Ca2+通道的活性，阻止Ca2+内流，从而使神经元囊泡释放出的谷氨酸（glutamate，Glu）水平降低，并最终降低Glu 兴奋性神经毒作用[5]。那么，运动是否通过上调纹状体mGluR2/3 表达水平从而介导了PD 模型大鼠纹状体MSNs功能运动依赖可塑性，目前尚未见到相关的实验证据。因此，本研究拟采用多通道在体电生理记录系统，对清醒静止状态下PD模型大鼠纹状体神经元电活动，如动作电位（spike）、局部场电位（local field potential，LFP）进行观察，并通过对各相关指标的综合分析，从纹状体神经元电生理学角度验证mGluR2/3介导了PD模型大鼠纹状体MSNs功能运动依赖可塑性这一假设。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

成年健康雄性清洁级SD 大鼠，体重240 ± 10 g（8周龄），购自北京华阜康生物科技股份有限公司[生产许可号：SCXK（京）2009-0007]。大鼠分笼饲养，3～4只/笼，12 h/12 h 昼夜循环，动物房内温度控制在22℃± 2℃。除了自由进食和饮水之外，在动物实验过程中，按照实验动物使用的3R 原则，给予人道主义关怀。正式实验前进行为期7 天的环境适应及强迫跑台适应性训练，剔除无法完成预设跑台训练方案的大鼠，随机分为假手术安静组（Control组，n=9）和6-OHDA 损毁造模组（6-OHDA 组，n=40）；6-OHDA 组经鉴定符合PD 模型的大鼠随机分为6-OHDA 安静组（PD 组，n=9）、6-OHDA+运动组（PD+Ex 组，n=9）和6-OHDA+运动+mGluR2/3拮抗剂组（PD+Ex+APICA 组，n=9）。

1.2 PD模型的建立与评价

大鼠禁食24 h，自由饮水。腹腔注射10%水合氯醛（0.35 ml/100 g）麻醉大鼠。于可调节的大鼠脑立体定位仪上充分暴露前后囟使之保持在同一水平面上。参照Paxionos 和Watson 大鼠脑定位图谱[6]确定右脑内侧前脑束（medial forebrain bundle，MFB）坐标（AP：-4.3 mm，R：1.5 mm，H：7.6~7.8 mm）作为6-OHDA 注射（2 μg/μL，1 μL/min，4 min）点，注射完毕留针5~10 min，缓慢退针。假手术组大鼠在相同注射点给予等量含0.02 %抗坏血酸的生理盐水。手术完成待大鼠清醒后放置笼内单笼饲养。

在手术完成后7 d，分别对各组大鼠进行阿扑吗啡（apomorphine，APO）诱导的旋转实验。实验在安静的环境下进行，按照每100 g 体重0.1 mg APO 的剂量将其溶液注射于大鼠的颈部皮下，计数30 min 时间内大鼠的旋转次数（大鼠以左侧后肢为轴，进行首尾相接的旋转行为）。本研究筛选净旋转圈数（逆时针方向旋转圈数减去顺时针方向旋转圈数）＞100 r/30 min作为PD大鼠模型制备成功的标准[7]，不符合PD 模型标准的大鼠剔除。

1.3 电极及给药套管的植入

6-OHDA 或者生理盐水注射完成之后，参照Paxinos 大鼠脑定位图谱[6]，确定纹状体电极（AP：0～1.7 mm，ML：2.5～3.7 mm，DV：4.5～5 mm）及给药套管（AP：0.0 mm，ML：-0.2 mm，DV：-6.0 mm）坐标后，分别将微电极阵列和给药套管植入相应位置并固定。手术后将大鼠单笼饲养，并连续3 d 常规腹腔注射青霉素10 万单位，以防术后感染。在此过程中随时注意观察大鼠的状态。大鼠自由进食和饮水，并随时观察其状况，必要时适当延长注射抗生素的天数。

1.4 黑质、纹状体TH表达水平检测

所有实验结束后24 h，各组大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）麻醉，依次经心脏灌注预冷的生理盐水（250 mL）和多聚甲醛（4 g/L，300 mL），断头取脑组织放入固定液中固定24 h，转入30%的蔗糖溶液至沉底，修块，包埋。参照Paxionos 和Watson[6]大鼠脑立体定位图谱确定纹状体和黑质位置，连续冠状切片，每隔3张选取1张切片在0.01 M 的PBS（pH 7.4）中漂洗后，室温下置于0.3% Triton X-100 的PBS 中破膜30 min，3% H2O2中孵育10 min，PBS 漂洗；脑片转入5%山羊血清的PBS 中室温孵育1 h，鼠抗TH 单克隆抗体（1∶3000）（Sigma，USA）孵育过夜；PBS 漂洗3 次后，室温下生物素化兔抗孵育1 h，亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC-Elitekit，Vector Laboratories，USA）孵育1 h，PBS 漂洗3 次，DAB 溶液中显色10~20 s。采用Olympus-DP72 型显微镜拍照，Image-Pro Plus 6.0软件统计分析酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxxylase，TH）平均光密度，判断DA能神经元的损毁情况。

1.5 mGluR2/3蛋白表达水平检测

采用免疫印迹技术检测纹状体mGluR2/3 蛋白表达水平。大鼠脑组织于冰面上，快速剥离右侧纹状体，采用BCA 法测定蛋白量后加入5 倍SDS，沸水煮5 分钟，冷却后于-80℃冰箱保存待测。取30 μg蛋白样品电泳分离后，置于PVDF膜上，再置入保鲜膜中，加入封闭液，室温条件下缓慢摇动90 min。将膜置于用TBST 溶解的5%脱脂奶粉中封闭。加入兔抗mGluR2/3 于4℃孵育24 h，PBS 洗膜，加入羊抗兔的二抗，置于摇床上，室温下孵育90 min 后，洗膜。室温反应1 h后加入化学发光液于膜上，X 射线曝光显影，以β-actin 为内参照，采用Image J 图像分析软件分析图片，以每个条带的积分光密度（IOD）值与其相对应的β-actin 的IOD值之比表示蛋白的相对量。

1.6 运动干预方案和mGluR2/3拮抗剂干预

术后1 周，采用Tajiri 等[8]建立的运动方案，对PD+Ex 组进行跑台运动干预。训练方案为：11 m/min，30 min/day，5 day/week（周六、日休息），持续4 周。在运动干预过程中，如果有大鼠不运动的情况，采用手动驱赶的方法使大鼠继续完成运动。运动干预时间安排在每个训练日下午16：00～18：00 进行。Control 组与PD组在相同时间段内同样置于跑台内，但不进行跑台运动，使其处于自然安静状态。

PD+Ex+APICA 组每次运动前，采用微量注射泵将mGluR2/3 拮抗剂APICA 注射到纹状体内，注射体积为1 μL，每次运动前20 min注射完毕。Control组与PD组在相同时间段内注射等体积的生理盐水，并同样置于跑台内，但不进行跑台运动，使其处于自然安静状态。

1.7 纹状体脑电信号的采集

参数的设置：在体多通道可以同时记录到spike 和LFP，通过对滤波器的设置可以将spike 和LFP 的信号区分开。设置动作电位的带通为250～5000 Hz，采样频率为2000 Hz；设置spike 的带通为250 Hz，采样频率为2000 Hz。软件参数的设置：设置Gain 值为2000；设置阈值线，使信噪比＞1∶3；勾选目标通道的spike、LFP 和原始信号。脑电信号的采集：将大鼠放置在屏蔽箱之内，等大鼠处于清醒静止状态的时候，开始对大鼠的脑电信号进行记录，同时用摄像机全程监控大鼠的状态。所记录的视频和脑电信号储存在电脑的硬盘中，以便离线分析。脑电信号的记录时长为30 min。

1.8 组织学观察

组织学观察主要是纹状体位置的鉴定。脑组织置于4%的多聚甲醛溶液中，4℃环境固定1 周左右后，转移至30%的蔗糖溶液中脱水直至沉底。包埋，切片，片后20 μm，按照先后顺序贴片。接下来将贴有脑组织切片的载玻片置于焦油紫染色液中进行染色。染色时间为5～10 min（因组织切片厚度而异）。蒸馏水洗，70%、95%和100%酒精分别脱水。二甲苯2 次，每次5 min，封片胶封片后，加盖玻片，进行显微镜观察，鉴定电极植入纹状体位置（图1）。剔除电极植入位置偏离的大鼠的数据。

图1 纹状体电极位点组织切片定位

1.9 纹状体电活动信号的分析

用Offline Sorter 软件对所采集到的spike 信号进行分析。设置滤波器的类型后，调整阈值线在＞1∶3处，进行分类处理完毕后，剔除干扰信号。将处理后的spike 信号导入NeuroExplorer 软件，分析神经元放电特征的变化，包括放电频率，时频、功率谱密度（power spectral density，PSD）等变化的分析。将采集到的LFP信号导入Matlab，对spike 诱发的 LFP 波形平均（spike-triggered wave-forms average，STWA）进行分析，同时计算spike-LFP的相位锁定值。

1.10 统计学方法

实验数据采用SPSS 20.0 统计软件包进行统计学分析，采用GraphPad Prism 8 软件作图。统计结果用均数± 标准差（±s）表示。采用独立样本t检验分析Control组与6-OHDA 偏侧损毁模型组大鼠旋转次数的组间差异；采用单因素（one-Way）方差分析（ANOVA）对TH-免疫反应性结果及mGluR2/3蛋白表达水平进行多重比较；采用双因素（two-Way）方差分析（ANOVA）对纹状体MSNs 平均放电频率和STWA 结果进行多重比较，然后使用Tukey事后检验进行组间比较。各组电生理数据的功率谱密度值采用非参数Kruskal-Wallis 检验，然后使用Nemenyi 事后检验进行组间比较。P＜0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 旋转测试和TH-免疫反应性结果

6-OHDA 注射后第7 天进行APO 诱导的旋转行为测试，结果表明，6-OHDA 偏侧损毁大鼠共40 只，旋转次数＞100 转/30 min（174.7 ± 6.82 转/30 min）的大鼠共计27 只，成模率67.5%，将未达到模型评价标准的大鼠剔除（图2 A）。

纹状体和黑质免疫组织化学染色结果显示，与Control 组相比，PD 与PD+Ex 组损毁侧黑质TH 免疫阳性细胞数量、纹状体TH 免疫阳性纤维终末含量均显著降低（P＜0.01）；与PD 组相比，PD+Ex 组黑质TH 免疫阳性细胞数量、纹状体TH 免疫阳性纤维终末含量无显著差异（P＞0.05）（图2B、C、D）。

图2 旋转测试和TH免疫反应阳性结果

2.2 运动对纹状体MSNs神经元放电频率的影响

通过对纹状体多个单位放电和LFP 的持续记录，比较各组大鼠纹状体神经元电活动的变化特征。根据波形、峰峰间隔、主成分聚类和放电模式，从背景噪声中分离神经元。基于半波宽（half-width）、放电频率和振幅，区分MSNs 和快放电中间神经元（fast-firing interneurons，FSIs）及大胆碱能中间神经元（large cholinergic interneurons，LANs）（图3）。根据研究的需要，筛选出MSNs的放电信号进行分析。4组大鼠纹状体共记录到177 个神经元，其中Control 组43 个，PD 组45 个，PD+Ex 组41 个，PD+Ex+APICA 组48 个。统计分析结果表明，与Control 组相比，PD 组、PD+Ex 组和PD+Ex+APICA 组纹状体MSNs 平均放电频率均显著升高（P＜0.01）；与PD 组相比，PD+Ex 组纹状体MSNs 平均放电频率显著降低（P＜0.05）；与PD+Ex 组相比，PD+Ex+APICA 组纹状体MSNs 平均放电频率显著升高（P＜0.01）（图4）。

图3 清醒状态下纹状体神经元单位放电的分离和分类

图4 各组大鼠纹状体MSNs平均放电频率比较

2.3 运动对纹状体神经元LFPs的影响

与Control 组相比，PD 组纹状体神经元LFP 节律性振荡在各频段整体上放电能量明显增强；与PD 组相比，PD+Ex 组纹状体神经元LFP 节律性振荡各频段在整体上放电能量有一定程度的降低，但仍然高于对照组；与PD+Ex 组相比，PD+Ex+APICA 组纹状体神经元LFP 节律性振荡各频段在整体上放电能量明显增强，较PD组无显著改变（图5）。

图5 各组大鼠纹状体神经元LFP比较

与Control 组相比，PD 组纹状体神经元 LFPs 在10~30 Hz 的β频段节律性振荡功率出现异常升高（P＜0.01），PD+Ex 组纹状体神经元LFPs 在10~30 Hz的β 频段节律性振荡功率较PD 组显著降低（P＜0.05），PD+Ex+APICA 组纹状体神经元LFPs 在10~30 Hz 的β频段节律性振荡功率较PD+Ex 组异常升高（P＜0.01）（图6）。

图6 各组大鼠纹状体神经元LFPs β频段功率谱密度比较

2.4 运动对纹状体神经元STWA变化的影响

对spike 诱发的LFPs波形平均（STWA）进行分析，以评估不同神经元自发spike 与LFP β振荡之间的相关程度。当unshuffled STWA 在0 ms 处超过原始spike 序列打乱1000 次后的shuffled STWA 的96% 置信区间时，spike被认为与LFP β振荡相关。典型的STWA 相关与不相关图如图7A、B 所示。与Control 组相比，PD 组spike 与β振荡之间的STWA 值显著升高（P＜0.01）；与PD组相比，4周运动干预后，PD+Ex组spike与β振荡之间的STWA 值显著降低（P＜0.05），但与Control组相比，PD+Ex 组spike 与β振荡之间的STWA 值仍显著升高（P＜0.05）；与PD+Ex组相比，PD+Ex+APICA 组spike与β振荡之间的STWA 值显著升高（P＜0.01），但与PD 组相比，spike 与β振荡之间的STWA 值无显著性改变（P＞0.01）（图7C）。

spike 与β振荡的相位锁定结果表明，Control 组β振荡相对于spike 的分布离散，分布范围广，呈随机分布，不具有显著锁相性；与Control组相比，PD 组β振荡相对于spike的分布范围窄，锁相明显；与PD组相比，PD+Ex组相位分布相对离散，分布范围相对较广，但与Control组相比仍处于较明显相位锁定；与PD+Ex 组相比，PD+Ex+APICA 组β振荡相对于spike的分布范围窄，锁相明显；与PD 组相比，PD+Ex+APICA 组β振荡相对于spike的分布范围无改变，锁相明显（图7D）。

图7 各组大鼠纹状体神经元STWA比较

2.5 运动对纹状体mGluR2/3蛋白表达水平的影响

Western blotting 结果显示，与Control 组相比，PD组纹状体mGluR2/3表达水平显著下调（P＜0.01）；与PD组相比，PD+Ex 组纹状体mGluR2/3 表达水平显著上调（P＜0.05）（图8 A、B）。

图8 各组大鼠纹状体mGluR2/3蛋白表达水平比较

3 讨论

神经元的主要电活动包括spike 和LFP。spike 是神经元的信息传递基础。LFP 是由突触电位等形成的，反映了记录部位局部区域神经元网络的电活动。LFP 中包含了各种频率[δ波（0.5～4 Hz）、θ波（4～8 Hz）、α（8～12 Hz）、β（12～30 Hz）、γ（30～80 Hz）等]的节律波。其中β和γ频带的振荡与运动和认知等高级神经信息的整合及处理过程密切相关。振荡是指电流周期性的波动或变化，包括同步性振荡和异步性振荡。同步性振荡是指能够维持同步且稳定运行的振荡，是大脑神经元对神经信号（信息）进行编码、整合和处理的重要潜在机制。而异步振荡是指神经元各自独立活动，失去同步化且不能够正常运行的振荡。

对spike 放电活动的分析能够反映单个神经元在不同状态下放电频率以及放电模式的改变；对LFP 的时频图以及功率谱密度（PSD）的分析，能够反映突触前终端和突触后神经元集群有节律的同步化活动；对STWA 的计算能够反映spike-LFP 的同步化程度；对spike-LFP 相锁值的计算显示了spike 发放的相位偏好，同样反映spike-LFP的同步化程度。

3.1 PD状态下纹状体MSNs异常电活动

纹状体几乎完全由抑制性细胞网络组成[大鼠的新纹状体γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）能和胆碱能神经元分别占到了99.7%和0.3%][9]，正常清醒大鼠纹状体MSNs 平均放电频率为1.1 ± 0.18 Hz[10]。Arbuthnott[11]、Schultz[12]和Nienbaum 等[13]研究表明，在正常生理状况下，纹状体的大多数神经元显示出较低的放电频率（大多数处于静息状态）。Liang 等[14]研究表明，PD 动物模型纹状体MSNs 放电活动显著增加。陈巍等[15]利用玻璃微电极对麻醉状态下PD 大鼠模型纹状体MSNs 电活动进行记录发现，PD 大鼠模型纹状体MSNs 平均放电频率、爆发式放电神经元的比例显著增加。

PD 状态下基底神经节各核团神经元电活动的特征，一是神经元放电频率增加，二是神经元放电模式趋于同步化[16]。据报道，基底神经节环路在正常状态下基本不会出现β频段振荡放电活动或者具有较低的β频段振荡放电活动[17]，然而，PD 状态下DA 耗竭可使基底神经节表现出强的β频段振荡，并使其同步化程度显著升高[18]。这种异常的同步化形式可能是PD 的一些症状在基底神经节网络水平活动上的反应，阻止正常的网络功能[19]。Engel 等[20]研究表明，LFP 的β频段（10～30 Hz）的振荡活动被认为与当前的运动状态的维持有关，β频段活动的异常增加很可能导致当前机体状态的异常维持及灵活性行为和认知控制的恶化。Costa等[21]采用药物遗传学方法对DA 转运体敲除小鼠的研究表明，急性DA 耗竭能够直接导致纹状体神经元LFP 的β频段振荡活动功率增强；Burkhardtl等[22]研究表明，纹状体同时注射D1 和D2 受体拮抗剂后，纹状体LFP 的β频段振荡活动的功率及spike 与LFP 振荡的同步化程度显著增加。Damodaran 等[23]采用计算机模型对内在通道和网络相互作用在调节纹状体网络活动方面的作用进行了研究，结果表明，在正常生理状态下，皮层spike与LFP振荡的同步性对纹状体spike与LFP振荡的同步性增加几乎没有影响，但是在DA 耗竭状态纹状体却显示出显著的同步性增强。Chen 等[24]采用多通道在体记录系统，对6-OHDA 诱导的PD 小鼠模型纹状体MSNs的活动模式进行研究表明，清醒状态下PD 小鼠模型纹状体MSNs 放电频率、爆发式放电活动显著增加，LFP的β频段的同步性震荡活动显著增加。Damodaran 等[25]采用纹状体网络模型研究表明，DA 耗竭会导致纹状体β频段振荡的功率显著增加。这提示PD 状态下LFP 的β频段振荡功率增强可能是病理性的，PD 运动功能障碍可能是基底神经节输出结构中的上述病理性振荡活动引起的。本研究采用多通道在体记录系统对清醒静止状态下PD 模型大鼠纹状体MSNs电活动进行观察发现，DA 耗竭导致纹状体MSNs LFP 的β频段（10～30 Hz）的振荡活动显著增加，平均放电频率显著增加，spike 与LFP 振荡之间的同步化程度显著增加，与之前研究[26]的DA 丢失导致偏侧损毁PD 模型大鼠基底神经节内选择性同步和振荡活动增加的研究结果一致，并认为PD 患者基底神经节LFP 的β频段范围异常同步和振荡功率增加与运动拮抗有关。但是，Chang 等[27]研究显示，PD 状态纹状体神经元的总体活动水平降低。造成这些研究结果不一致的原因可能与实验在不同的脑状态下（麻醉和清醒状态）进行以及实验的物种不同（不同物种间神经投射在比例上可能存在差异）等因素有关。

3.2 运动对PD模型大鼠纹状体MSNs异常电活动的影响

研究表明，DA 丢失可能导致基底神经节各个核团之间及基底神经节-皮层之间异常的振荡活动和同步性增加[28]。这种形式的振荡活动和同步化已被证明与运动功能障碍有关[29]，且这一活动可能会被DA 替代疗法和深部脑刺激（deep brain stimulation，DBS）所抑制[30]。Neumann 等[31]研究表明，PD 患者丘脑底核在未服药过程中β频段（13～35 Hz）振荡功率谱出现峰值，而左旋多巴（levodopa，L-DOPA）治疗后可显著抑制该频段的振荡活动，并显著改善患者的运动功能障碍；Trager 等[32]研究表明，长期高频神经元DBS 可使PD 患者丘脑底核（subthalamic nucleus，STN） LFP 的β 频段（13～30 Hz）振荡的功率显著降低，且在长期高频神经元刺激终止后仍可使STN β 频段振荡活动减弱。Tseng 等[33]采用在体胞内记录显示，系统注射DA 受体激动剂可使6-OHDA 损毁所诱导的纹状体膜电位改变逆转。Suarez 等[34]研究表明，PD 状态纹状体MSNs 较对照组大鼠更兴奋，而L-DOPA 治疗后兴奋性降低至正常值。Wang等[35]研究表明，6-OHDA 诱导的偏侧DA能神经元损伤大鼠纹状体LFP 震荡活动显著增加，表现为大鼠在清醒静止状态下24～36 Hz 频段的振荡功率显著增加，低剂量L-DOPA 注射使其LFP 功率显著降低。Damodaran 等[36]研究认为，去同步化快放电中间神经元（fast-spiking interneurons，FSIs）活动的药物可能为PD 纹状体LFP 的β频段振荡活动增加、放电失衡以及运动功能障碍提供一种新的治疗策略。

而有关运动对PD 纹状体MSNs异常电活动影响的研究报道较少。本实验室前期利用玻璃微电极对运动干预后麻醉状态下PD 大鼠模型纹状体MSNs电活动进行记录发现，运动干预可使PD 大鼠模型纹状体MSNs放电频率及爆发式放电神经元的比例显著降低[37]。本研究采用多通道在体记录系统对运动干预后清醒静止状态下PD 大鼠模型纹状体MSNs 电活动进行记录发现，4周中等强度跑台训练后，纹状体MSNs平均放电频率、LFP 的 β频段（10～30 Hz）振荡活动的功率以及spike 与LFP β频段振荡之间的同步化程度均显著降低。本研究结果表明运动干预能够阻止这种异常振荡活动及其同步化程度。

3.3 mGluR2/3介导了运动对PPDD 模型大鼠纹状体MSNs异常电活动的影响

研究表明，PD 皮层-纹状体Glu 能通路过度激活，突触前Glu大量释放[38]。Glu与位于基底神经节不同结构中的Glu 能受体及胞内主要的分子元件相互作用，导致纹状体MSNs树突棘结构的改变可能是PD 病理生理学和异常电生理学活动改变的机制之一。因此，阻止Glu 的过度释放或者抑制Glu 功能效应的发挥可以抑制PD 纹状体MSNs 异常电活动改变并最终改善PD相关行为功能障碍。而Glu 作为中枢神经系统内一类重要的兴奋性神经递质，其生物学效应的发挥是通过与其受体的结合来实现的。

研究表明，离子型谷氨酸受体（ionotropic glutamate receptors，iGluR）拮抗剂，特别是那些作用于N-甲基-d-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptors，NMDARs）（介导Glu 兴奋性神经毒性的主要受体）的iGluR 拮抗剂，在许多临床前期研究中显示出了积极的抗PD 作用和治疗潜力，但是利用非选择性iGlu 受体拮抗剂会产生严重的副作用（包括精神错乱、幻觉、学习和记忆障碍），限制了其在临床上的应用[39]。近些年来，研究者将目光转向了代谢型谷氨酸受体（metabotropic glutamate receptors，mGluR），并发现mGluR 可能是治疗PD 的主要靶点[40]。mGluR 主要分为3组、8个亚型：Ⅰ组，包括mGluR 1 和5，与磷脂酶C（Phospholipase C，PLC）和三磷酸肌醇（inositol trisphosphate，IP3）/Ca2+/蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）通路正偶联，它们的激活可使胞内的内质网钙库释放Ca2+，位于突触后膜上，分布在离子通道型受体如NMDAR 的边缘，增强由iGluR所介导的兴奋性神经毒性；Ⅱ组，包括mGluR 2 和3，定位于皮层-纹状体突触前末梢，与腺苷酸环化酶（adenylate cyclase，AC）负偶联，它们的激活会引起AC 信号传导的降低，导致下游电压依赖型钙通道的抑制，mGluR2/3 作为自身受体负调控皮层-纹状体突触前轴突末梢Glu 的释放，并阻止NMDARs 的进一步激活；Ⅲ组，包括GluR 4/6/7/8，与mGluR2 和3具有相似的属性，也与AC 负偶联，它们的激活会抑制AC 的信号传导，从而降低环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）的生成，改变蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）通路的活性，还可抑制电压依赖性钙通道的活性，位于突触前膜上，作为自身受体可减少突触前Glu 的释放[41]。由于mGluRs 各亚型存在区域性分布的特征，因此，尽管mGluR 1 和5 拮抗剂也能够有助于PD 症状的改善或者缓解，但是由于mGluR 1和5 在黑质致密部（pars compacta of substantia nigra，SNpc）DA 能神经元轴突末梢也有分布，因而非选择性mGluR 1 和5 拮抗剂会阻断mGluR 1 和5 所介导的SNc DA 能神经元释放神经递质DA的增加，这对PD的治疗可能不利。特异性的激动GluR 4/6/7/8虽然对PD症状的改善或者缓解也有利，但是，mGlu 7和8由于缺乏高度的选择性和有效的配体而限制了它们的使用。目前，mGluR 2和3激动剂的治疗已经被部分应用于临床且效果显著，成为迄今治疗PD 最有应用前景的一组mGluRs。

本研究结果发现，运动干预可使PD 模型大鼠纹状体MSNs 平均放电频率、LFPs 在β频段（10～30 Hz）振荡的功率以及spike 与LFP 的β频段振荡之间的同步化程度均显著降低，而GluR 2/3 拮抗剂（APICA）可使PD+Ex 组大鼠纹状体MSNs 平均放电频率、LFP 在β频段（10～30 Hz）振荡的功率以及spike 与LFP β频段振荡之间的同步化程度显著增加，且较PD 组无显著差异。这表明运动抑制PD 模型大鼠纹状体MSNs异常电活动可能与运动通过激活纹状体GluR 2/3，降低皮层-纹状体通路突触前过量的Glu 释放，进而抑制Glu 与位于基底神经节不同结构中的Glu 能受体及胞内主要分子元件的相互作用，最终逆转纹状体MSNs树突棘结构的改变有关。本实验室前期研究发现，运动干预可使PD 模型大鼠纹状体Cav1.3 蛋白表达水平显著下调，纹状体mGluR 2/3 蛋白表达水平显著上调，纹状体不对称性突触中穿通型突触的比例、纹状体MSNs平均诱发放电频率、爆发式放电神经元的比例显著降低，刺激皮层时纹状体神经元的阈强度显著增加，放电频率增加的潜伏期显著延长[15，42]，本研究结果与之一致。

4 小结与展望

本研究结果显示，PD 模型大鼠纹状体MSNs 兴奋性显著增强，LFP β频段节律性振荡的功率显著增加，spike 与LFP β频段节律性振荡的同步化程度显著增加；运动干预可使PD 模型大鼠纹状体MSNs 兴奋性、LFP β频段节律性振荡的功率以及spike与LFP β频段节律性振荡的同步化程度显著降低；纹状体微量注射GluR 2/3 拮抗剂可使运动的积极效应消失，进一步证实mGluR 2/3 在PD 模型大鼠纹状体MSNs 运动依赖可塑性中发挥了重要作用，并将成为PD 治疗药物研发的新的靶向分子。

经典理论认为，DA 可分别通过激活纹状体传出神经元上的多巴胺D1 受体（dopamine D1 receptor，D1DR）兴奋表达多巴胺D1 受体的中等多棘神经元（dopamine D1 receptor medium spiny neurons，D1-MSNs）或激活纹状体传出神经元上的多巴胺D2 受体（dopamine D2 receptor，D2DR）抑制表达多巴胺D2 受体的中等多棘神经元（dopamine D2 receptor medium spiny neurons，D2-MSNs），最终达到实现易化运动的效果。而纹状体DA 耗竭会导致皮质活动抑制并最终导致运动功能障碍的产生。在PD 状态，纹状体DA耗竭分别降低和增强了D1-MSNs 和D2-MSNs 兴奋性。推测：D2-MSNs神经元集群的兴奋性增强了PD状态纹状体MSNs β频段的振荡活动，运动干预对纹状体MSNs 异常电活动的影响是通过抑制D2-MSNs 神经元集群的兴奋性水平来实现的。本实验室在接下来的研究中将利用转基因小鼠，结合光遗传手段和膜片钳技术对这一假设进行验证。