青蒿素资源保障策略及影响因素研究进展＊

马婷玉，向 丽，徐志超，陈士林，宋经元＊＊

（1. 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，国家中医药管理局中药资源保护重点研究室 北京 100193；2. 中国中医科学院中药研究所中药鉴定与安全性检测评估重点实验室 北京 100700；3. 东北林业大学东北盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室 哈尔滨 150040）

青蒿素(artemisinin)是一种含有特殊过氧桥结构的倍半萜类化合物，20世纪70年代首次由中国科学家从中草药黄花蒿（Artemisia annuaL.）地上部分中提取并确定其化学结构[1,2]。青蒿素是目前世界上治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾最有效的药物，具有低毒、速效、与氯喹啉无交叉抗性的抗疟效果[3,4]。随着青蒿素及其衍生物临床适应症的研究不断发展，市场对青蒿素的需求量也日益增加。

青蒿素作为重要的天然产物，已成为国际研究热点。目前市场上供应青蒿素主要以黄花蒿植物提取为主，优质的黄花蒿资源主要分布在我国秦岭-淮河以南地区，湖南和广西是种植黄花蒿的两大产区。近年来青蒿素价格在1200 元/kg 左右，企业利润单薄，青蒿素原料药材占成本60%左右，青蒿素含量每提高0.1%，可降低成本10%左右[5]。因此，迫切需要一种全面的、可持续的策略来增加青蒿素的供应。在适宜的产区以合理栽培方式种植优良黄花蒿品种是保证青蒿素提取的重要前提。除了来自植物的天然产物提取方法，还可通过人工合成的方式获取青蒿素，如通过合成生物学在微生物底盘细胞中重构天然产物的异源合成途径[6,7]。还可通过化学合成的全合成和半合成生产青蒿素，化学全合成主要以香茅醛、薄荷醇等为原料，半合成结合了合成生物学和化学合成，以青蒿酸为原料最终合成青蒿素[8,9]。本文从天然产物提取和人工合成的角度展开综述，介绍青蒿素资源保障策略的重要性，对其他重要天然产物如紫杉醇、长春碱、人参皂苷等资源保障具有重要参考价值。

青蒿素的资源保障策略涵盖了天然产物生物合成保障、合成生物学保障和化学合成保障，该策略是保证黄花蒿中药材和青蒿素产业发展的有效策略（图1）。我们将通过选择适宜黄花蒿种植区域、选育黄花蒿优良品种、加强栽培技术，结合青蒿素合成生物学、化学全合成、半合成等策略有效提高青蒿素收率，介绍各个实施环节的进展和影响因素，保障青蒿素资源的可持续利用。

图1 青蒿素资源保障策略图

1 青蒿素天然产物生物合成保障

1.1 黄花蒿倍半萜类天然产物概况

目前国内外从黄花蒿中提取的倍半萜类化合物近60 种[10]，包括青蒿素、法尼基焦磷酸(farnesyl diphosphate，FPP)、紫穗槐-4,11-二烯、青蒿醇、青蒿醛、青蒿酸、双氢青蒿醇、双氢青蒿醛、双氢青蒿酸、青蒿乙素等青蒿素合成途径主要化合物（如图2）。Bhakuni 等[10]从黄花蒿全草中分离得到artemisin、arteannuic alcohol、abscisic acid、abscisic acid methyl ester。Brown 等[11]采用HPLC 和硅胶色谱柱技术从黄花蒿种子中提取分离出annulide、iso-annulide、cedina-3α, 15-dihydroxy、secocadinane-artemisia、dihydroxycadinolide-artemisia、 eudesma-4(15),11-diene、eudesma-4(15),11-diene,5α-hydroperoxy、环氧青蒿酸等。Misra 等[12]利用硅胶色谱柱在黄花蒿地上部分中分离得到annuic acid。屠呦呦等[13-14]利用硅胶色谱法从黄花蒿全草分离得到青蒿素A、B、D、E，青蒿丙素。Sy 等[15]从黄花蒿叶片中分离出青蒿素H、I、J、K、L、M、N、O。倍半萜类成分为黄花蒿的特征性成分，其中青蒿素是黄花蒿特有的倍半萜类化合物，其在黄花蒿植株不同组织部位含量分布不同，主要分布于黄花蒿叶片、花蕾、茎部表面的分泌型腺毛。倍半萜类化合物法尼基焦磷酸（FPP）作为中间产物，也是MVA 和MEP两个途径合成青蒿素的重要节点化合物，紫穗槐-4,11-二烯是青蒿素合成的起始化合物，其在酶促作用下逐步合成下游的青蒿醇、青蒿醛、双氢青蒿醇、青蒿酸等中间产物，最终合成青蒿素[16]。

图2 黄花蒿主要倍半萜类成分列举

随着提取技术的进步，有效提高天然产物提取效率的同时也降低了原料成本。因此，提取技术的优选是天然产物工业化发展环节的关注重要。青蒿素提取有多种方法，传统提取方法主要有室温提取、索氏提取、冷浸提取、冷循环提取、回流提取、丙酮-硅胶柱层析法等[17-20]。随着提取工艺的发展新技术也逐步应用于青蒿素提取中，例如微波萃取法可缩短加热时间提高青蒿素的萃取率[21]。超临界提取技术可减少提取时间，使提取率得到提升[22]。生物酶辅助提取法使用纤维素酶进一步增加了黄花蒿植株中活性成分的提取效率[23]。目前，石油醚为溶剂的溶媒提取以其安全性高、成本低等特点成为企业提取青蒿素最常用和经济的方法[24]。

1.2 影响青蒿素天然产物生物合成保障的主要因素

1.2.1 自然生态环境对青蒿素天然产物生物合成的影响

生态环境是影响中药材种植和生长的重要因素，适宜的生态环境可影响黄花蒿药材的品质。黄花蒿主要适宜生长在亚洲温带、寒温带及亚热带季风气候区域。黄花蒿分布和生长在不同环境中，由于对不同的环境生态因子的长期趋异适应的结果，形成具有各自稳定形态或生理生态特征的不同个体群即生态型。黄花蒿的生态地域性由不同生态型之间的生理生化特征差异引起，其资源品质的生态地域性本质与环境生态因子密切相关[25]。

生态适宜性分析平台研究黄花蒿的空间分布与气候因素的关系，发现纬度与黄花蒿分布密切相关，影响黄花蒿分布的环境生态因子主要是年均降水量、年均相对湿度、年均日照以及最热季均温[5]。黄花蒿生长的95-100%气候相似区为南纬25°和北纬25°附近的亚热带季风气候区域，是适宜高青蒿素含量黄花蒿生长的生态环境[26]。通过《药用植物全球产地生态适宜性信息系统》(geographic information system for global medicinal plants,GMPGIS)技术分析产地适宜性表明，亚洲101.89°～141.08°E 之间是黄花蒿的生态适宜产区，预测结果可进一步实践和验证[5]。

本研究组根据野外调研和文献资料查阅，选择青蒿素含量较高的中国南方地区进行野生资源采集，包括海南（海口、琼中、儋州）、湖南（沅江、永安、桑植、怀化）、广西（南宁、柳州、全州）、贵州（铜仁）、四川（宜宾、成都）、重庆（酉阳、江津）。为进一步完善黄花蒿种质资源库，同时收集了包括江苏、浙江、福建、江西、贵州、云南、河南、河北、湖北、北京、天津、山东、安徽、西藏、新疆、甘肃、青海、陕西、山西、黑龙江、辽宁、吉林等21 个省份的市/县/乡野生资源（图3），并在广西、四川、江苏、海南、北京和湖北建立种质资源圃，为黄花蒿种质资源的选育提供保障。

图3 黄花蒿种质资源库及新品种快速选育平台

黄花蒿生存适应性强且分布广泛，在中国大部分省市均有分布。通过对黄花蒿栽培资源的产地环境调研，青蒿素含量较高的产地主要分布在秦岭-淮河以南[5,27]。亚热带地区青蒿素含量在0.4-0.7% 之间，在温带和寒带地区青蒿素含量低于0.1%，中国亚热带湿润气候区中的青蒿素含量平均值大于0.5%[5-7]。目前，黄花蒿栽培资源在中国的适宜产区包括湖南、广西和贵州。其中，湖南省适宜栽培资源种植产区面积占全国总产区面积的15%，广西、贵州分别占全国总产区的14%和12%[28,29]。北方地区的黄花蒿野生资源青蒿素含量较低，如内蒙古、黑龙江、北京、山东、安徽和湖北部分地区等。据报道，将位于北纬23°-30°间包括广西、云南、四川、湖南等地的优质黄花蒿引种于黑龙江各地，引种品种含量低于原产地且含量差异较大[30]。将重庆、广西、青海、河南的黄花蒿引种到海南，除青海外其余产地的黄花蒿药材中青蒿素含量高于原产地[31]。因此，选择适宜的产地环境是实现黄花蒿优良栽培的重要前提，并且能有效保障黄花蒿的药材品质。

1.2.2 种质资源对青蒿素天然产物生物合成的影响

黄花蒿优良种质选育对提高青蒿素天然产物产业具有重要意义，优良的种质资源对提高青蒿素提取产率，降低提取成本具有重要意义。黄花蒿良种选育工作可分以下步骤具体实施：第一步：筛选黄花蒿外观性状佳，包括株型紧凑、叶裂片排列紧密、叶片卵形或菱形、叶色深，以及青蒿素含量高的种质，基于基因组重测序的Indel 分子标记筛选优良性状标记；第二步：通过集团选育、杂交、混合选育等获得新品种；第三步：通过组织培养、扦插、温室培养等快速繁育新品种；第四步：结合黄花蒿龙头企业+农户+科研产业化进一步推广黄花蒿新品种，实现黄花蒿新品种快速选育平台的建立(图3)。针对不同选育需求，黄花蒿良种选育平台建立了系统完善的工作流程，为黄花蒿优良种质资源的补充和保存提供了有力的保障。

自2005 年以前，由于青蒿素原料价格处于高位，因此许多人盲目使用野生种子和低含量品种栽培，盲目种植出现了种植品种混杂，原料青蒿素含量较低等问题，导致厂家拒绝收购，农户损失惨重等[32]。近几年，随着青蒿素价格持续低迷，对黄花蒿高产高含量新品种需求越来越高。前期通过传统选育获得的黄花蒿新品种，包括桂蒿1 号、桂蒿2 号、桂蒿3 号、药客佳蒿1 号、鄂青蒿1 号、渝青1 号、渝青蒿2 号、湘蒿1号、湘蒿2 号、湘蒿3 号、湘蒿4 号等，青蒿素含量均在1%左右；研青1号、中康优青1号、中康优青2号、科蒿1 号、科蒿2 号、科蒿3 号等，青蒿素含量均在2%左右（表1）[33-37]。随着分子育种、辐照育种等新技术的使用，将会获得更多优良品系。黄花蒿的生产需采用高含量、高产量、抗性强等优质特征的黄花蒿品种作为人工栽培的良种种源。

表1 黄花蒿新品种类型及特征

1.2.3 生产栽培技术对青蒿素天然产物生物合成的影响

黄花蒿的生产栽培技术是影响青蒿素产量的重要因素。黄花蒿的药材质量与种植环境、种植方式、光照、水分、品种、施肥、连作等密切相关[38-39]，合理的栽培技术可有效提高黄花蒿药材品质。种苗田间综合管理和合理施肥是影响黄花蒿栽培的最主要因素，其次为病虫害和综合防治，最后为采收和贮藏。

优质种苗田间综合管理是栽培技术中影响黄花蒿药材产量的重要因素之一，包含移栽、合理配置株行距、合理灌溉及田间除草[40]。黄花蒿耐涝性较弱，忌干旱，播种期和苗期对水分有较高要求，水分不足会使种子发芽率降低，而灌溉较多或排水不畅会使病害增多，易出现根腐病和茎腐病。三对真叶长前的幼苗期植株生长量小，土壤过于干旱或水分过多都将影响幼苗生长，应及时灌溉[41]。黄花蒿植株横幅较大，还应注意合理配置株行距，平地株行距100 cm×100 cm 开穴；坡地株行距80-100 cm×80-100cm 开穴。移栽后田间及时除杂草，定时对根部培土。

合理施肥是中药材栽培生产的重要部分，也是栽培技术中影响黄花蒿药材产量和含量的重要因素之一。黄花蒿合理施肥应釆取不同施肥措施，不仅要做到适时施肥，还应保证氮磷钾合理使用，有机、无机肥料配合，以及微量元素的喷施等，不断提高有效成分的累积[42-43]。黄花蒿不同器官在不同生长期的养分主要以K 变化最大，P 变化最小。黄花蒿植株内N、P、K的积累在快速生长期后至现蕾期前后期变化较大，高施肥后N、K主要转移至根、茎和枝叶中，P主要转移至根和枝叶中，高施N、K、P肥和中施N、K、P肥有助于青蒿素含量的积累[44-45]。因此，黄花蒿施肥需注重含N、K、P的复合肥施用。

病虫害和综合防治会直接影响药材的产量和采收。黄花蒿田间栽培发生病害和虫害较少，其综合防治主要分为化学防治和物理防治。针对黄花蒿病害和虫害种类，科学合理选用化学防治技术，采用高效、低毒、低残留的农药，以降低农药残留及重金属污染等[46,47]。病害主要包括根腐病、茎腐病和白粉病。根腐病和茎腐病可用恶霉灵、多菌灵等进行防治，白粉病可用代森锰锌、三唑酮防治。预防病害物理防治包括合理密植、及时排水，降低土填湿度，适量施加氮肥，增强磷钾肥和有机肥，还可选用抗性品种[48]。虫害主要为蚜虫、象甲虫、菊瘿蚊、蛴螬和小地老虎。蚜虫和菊瘿蚊的化学防治可使用吡虫啉、啶虫脒等按剂量喷雾，象甲虫可用菊酯类杀虫剂，蛴螬和小地老虎可用辛硫磷进行防治。蚜虫的物理防治可采用黄板诱虫消灭，蛴螬、小地老虎成虫均有趋光性，可用黑光灯、频振式杀虫灯诱杀成虫。菊瘿蚊生长季及时摘除虫瘿并销毁。发现象甲虫时，在植株下方铺放塑料薄膜，可轻晃植株并集中消灭掉到薄膜上的象甲虫[46-48]。在无法避免使用农药的情况下，应尽量减少使用次数和使用量，且在采收前30天内不得施用化学农药。

科学的采收和贮藏方式会有效提升黄花蒿药材质量和减少青蒿素损耗。黄花蒿的采收时间为现蕾前，一般应在八月份生长盛期采收[49,50]。黄花蒿干叶中青蒿素含量随贮藏时间而逐渐降解，放置半年的干叶中青蒿素含量可降解30%[51-52]。因此，合理加工和贮藏黄花蒿干叶能提高青蒿素的提取价值，并有效降低生产成本。

目前，市场上通过黄花蒿植物提取仍然是最主要获取青蒿素的方法，因此选择适宜的生态环境、优良的种质资源和科学的栽培技术是提高青蒿素天然产物生物合成保障的重要因素。随着青蒿素及其衍生物适应症的扩大，全球每年对青蒿素及其衍生物的需求量逐渐增加，黄花蒿天然产物生物合成保障策略因其容易操作、成本较低和产量保障，成为目前最理想和经济的保障策略。

2 青蒿素合成生物学保障

2.1 青蒿素合成生物学途径

随着青蒿素生物合成途径的逐步阐明，其合成生物学研究也随之发展起来。二氢青蒿酸和青蒿酸在青蒿素生物合成中通过酶促或非酶促的光氧化反应生成青蒿素，但青蒿素最后一步生物合成的分子机制尚不明确，目前主要以合成生物学制备的青蒿酸为底物，再通过化学合成获得青蒿素。

Keasling 等[53-54]使用合成生物学将紫穗槐-4,11-二烯合酶（amorpha-4,11-diene synthase，ADS）和酿酒酵母细胞中的甲羟戊酸途径（MVA）途径引入大肠杆菌中，前体物质紫穗槐-4,11-二烯的产量达到24 mg/L，进一步研究将HMG-CoA 合酶引入大肠杆菌，紫穗槐-4,11-二烯产量达到27 mg/L；后续通过优化法尼基焦磷酸生物合成途径，以酿酒酵母细胞为底盘细胞，选择青蒿酸为底物，将紫穗槐-4,11-二烯合酶（ADS）、细胞色素还原酶（cytochrome P450 reductase，CPR）和细胞色素 P450 单加氧酶（amorphadiene-12-hydroxylase，CYP71AV1）在底盘细胞中表达，使得青蒿酸的产量达到153 mg/L[55]。研究表明，CEN.PK2 酿酒酵母更适合成为萜类化合物生物合成的底盘细胞，并可进一步优化合成步骤实现青蒿酸的大量生成，例如：通过过表达甲羟戊酸途径基因增加前体物质累积；实现高密度发酵，使紫穗槐-4,11-二烯的产量达到40 g/L[56]；引入青蒿醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1），优化发酵条件后得到的青蒿酸产量达到25 g/L[7]。

2.2 影响青蒿素合成生物学保障的主要因素

2.2.1 青蒿素生物合成途径与关键酶基因的调控

明确的生物合成途径是保证倍半萜类活性成分合成生物学顺利进行的重要前提，因此国内外学者开展解析青蒿素生物合成途径的研究，为青蒿素及青蒿酸等活性成分的合成生物学研究提供支撑。如图4所示，青蒿素生物合成途径上游所需的2 分子异戊烯基焦磷酸（IPP）和1 分子二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)由细胞质中的甲羟戊酸途径（MVA）和质体中的异戊二烯途径（MEP）两个途径共同产生[57]。法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase，FDS)通过催化异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)生成青蒿素的重要前体物质法尼基焦磷酸（FPP）；进一步地，紫穗槐二烯合酶(ADS)催化FPP 环化产生紫穗槐-4,11-二烯，这是合成途径的第一个直接前体物质；再通过CYP71AV1 和CPR 催化紫穗槐-4,11-二烯，经三步氧化反应产生青蒿醇、青蒿醛和青蒿酸；青蒿醛通过青蒿醛双键还原酶（artemisinic aldehyde delta11(13)-reductase，DBR2/DBR1）催化后被还原为双氢青蒿醛，再由ALDH1 催化后转化为双氢青蒿酸；青蒿醛经CYP71AV1、ALDH1 和CPR 催化后被氧化为青蒿酸。最后，双氢青蒿酸通过非酶促的光氧化反应生成青蒿素，青蒿酸可能经历了多步反应合成青蒿乙素，最后由青蒿乙素转化为青蒿素[58-59]。生物合成途径的明确解析为利用合成生物学技术和改造大肠杆菌及酵母菌株生产合成青蒿素奠定了基础。

图4 青蒿素生物合成途径

青蒿素生物合成途径关键酶调控研究使得基因工程手段能够有效增加黄花蒿植株中青蒿素的含量。已报道合成途径中HMGR，FPS，DXR，ALDH1，ADS，DBR2 等单基因过表达，但青蒿素含量增幅有限；因此通过多基因过表达可进一步增加青蒿素累积，例如ADS/CYP71AV1/CPR，CYP71AV1/CPR，HMGR/ADS，HMGR/FPS，FPS/CYP71AV1/CPR多基因组合；也可以通过下调竞争支路基因的表达，增加前体物质FPP 流向青蒿素代谢途径。因此，基因工程有效策略也能同时增强青蒿素生物合成途径中关键酶基因的表达。随着分子调控机制研究的深入，WRKY、AP2/ERF、bZIP、bHLH 等转录因子也被发现参与青蒿素生物合成调控。例如Ma 等[60]克隆了一个WRKY 类转录因子AaWRKY1，可促进ADS基因表达，从而增加青蒿素在植株内的积累。AP2/ERF 类转录因子AaORA 在黄花蒿分泌型腺毛（GSTs）中特异性表达，转基因植株中过表达AaORA基因可以上调ADS，CYP71AV1 和DBR2 关键基因的表达，从而促进青蒿素生物合成[61]。AabZIP1具有促进ADS和CYP71AV1 基因表达的作用[62]；AabHLH1也被报道能够促进ADS和CYP71AV1基因表达，提高青蒿素的积累[63]；唐克轩[64]等报道了一个bHLH 转录因子AaMYC2 能够提高CYP71AV1 和DBR2基因表达，从而促进青蒿素合成。此外，过表达和抑制AaMIXTA1基因，会分别导致转基因黄花蒿的GSTs数量和青蒿素含量的增加和降低，转录因子AaMIXTA1在青蒿腺分泌腺毛的生成和表皮胶质层的生物合成中发挥作用[65]。此外，青蒿素调控核心转录因子AaORA 能够与AaTCP14 形成复合物，在茉莉酸刺激下共同激活关键酶基因促进青蒿素的合成[61,66]。

2.2.2 青蒿素合成生物学的生物元件和底盘细胞开发

生物元件是经过功能表征鉴定、编码某种生物学功能的核苷酸序列。植物天然产物合成途径的解析过程，实际上就是发现与鉴定参与合成反应的关键酶编码基因的过程。合成生物学将天然产物合成所必需的生物元件构建成相应的合成途径，转入到合适的底盘细胞中进行异源合成。开发和优化青蒿素生物合成途径各个关键酶基因的效率，如增加基因拷贝数、启动子修饰、密码子优化等，能够增加基因的表达效率，进而有效地提高工程菌中青蒿酸等重要前体物质的产量[67]。其次，底盘细胞的性质差异会对天然产物的产量造成较大影响，选择适合该物种天然产物的底盘细胞是合成生物学的关键步骤。目前已报道使用的底盘细胞包括大肠杆菌、酿酒酵母、植物细胞和其他微生物。大肠杆菌是原核生物，也是所有工程菌中发展最早的一类，由于其适合表达不同基因产物，且易操作、生长速度较快、生长周期较短，成为合成生物学研究中首选的底盘细胞。已在大肠杆菌中合成青蒿酸[68]、紫穗槐-4, 11-二烯[69]等前体化合物。酿酒酵母是真核生物，更适合细胞色素P450 氧化酶等表达。酿酒酵母在青蒿素合成生物研究中占有重要的地位，可作为紫穗槐-4,11-二烯[70]、青蒿酸[71]和二氢青蒿酸[72]等重要中间产物的底盘细胞（图5）。植物细胞也同样具有精细的调控系统，虽然利用植物表达系统制备的萜类化合物产量较低，但植物表达系统也是获得代谢产物种类最多的底盘细胞。通过烟草植株已获得紫穗槐-4,11-二烯[73]、青蒿醇[74]、二氢青蒿醇[74]、青蒿酸糖苷[75]和青蒿素[76]代谢产物[70]。除以上底盘细胞外，曲霉也被报道用于生产和制备紫穗槐-4,11-二烯[77]。

图5 青蒿素前体物质的酵母工程菌研究

2.2.3 青蒿素合成生物学的工艺优化

天然产物合成途径的生物元件和底盘细胞开发仅仅是实现生物合成的前提条件，还需优化合成生物学的工艺，目的保证有更多的代谢流进入青蒿素生物合成途径，工艺优化也是提高工程菌产量的关键。

青蒿素合成生物学的具体工艺优化包括：一、增加前体物质供应和提高底物利用效率。首先，对代谢途径上下游的基因进行改造或优化可有效增加中间体产量，如增加目的基因拷贝数，修饰启动子，密码子优化等。孔建强等[78]增加HMGR和FPP编码基因拷贝数，有效提高紫穗槐-4,11-二烯含量。其次，青蒿素合成的特异途径是在ADS 的竞争作用下将上游生成的部分FPP 引入青蒿素生物合成途径。因此，将更多的FPP引流至青蒿素特异途径是提高工程菌中青蒿素及中间体产量的重要措施。Keasling 等[55]强化表达MVA途径全部关键基因，增加前体FPP 的积累，是提高工程菌产量的有效方式，这一措施使得前体物质的合成拥有充足的代谢流。同时应当减少前体物质的流失，除了合成青蒿素，FPP 同样也是其他倍半萜类化合物的前体物质，应抑制青蒿素的竞争支路基因表达，减少FPP 流入其他途径，增加FPP 流入青蒿酸合成途径并提高其产量[69,78]。最后，通过异源底盘细胞重构代谢途径，使用活性更强的同工酶代替原来途径的酶，增加重构代谢途径中酶的催化效率，可有效增加工程菌中目的代谢物产量。通过上述有效措施，可增加底物利用效率，在提高单个基因效率的同时也优化平衡整条代谢途径，对最终产物的影响也是最直接的。

二、优化培养和生产条件。培养条件对工程菌产生青蒿素及其前体物质有相当大的影响。如在发酵大肠杆菌工程菌生产青蒿酸时去除有机相覆膜可显著提升青蒿酸的产量[68]。在发酵制备紫穗槐-4,11-二烯过程中加入有机相，紫穗槐-4,11-二烯产量显著增加[69]。因此，选择适当的条件优化可针对不同对象进行设计。此外，不利的细胞质环境阻止后期青蒿素前体的形成也是青蒿素含量低的原因。为了克服这一限制，Farhi 等[76]在烟草中异源合成青蒿素，利用信号肽cox4与ADS 融合表达，再通过质体导肽将CYP71AV1、DBR2、CPR 定位于叶绿体内，最后在叶绿体中引入整条酵母MVA途径增加萜类前体供应，获得的烟草植株中青蒿素高达0.8 mg。该研究有效提高转基因烟草中二氢青蒿酸的表达量，高效地将二氢青蒿酸氧化为青蒿素。

通过合成生物学制备青蒿素及其中间体的研究成功，无论对青蒿素本身还是对未来天然药物的生产格局都会产生深远的影响。通过合成生物学制备青蒿素，不受环境和土地的制约, 能在短时间内获得大量的青蒿素, 能稳定世界市场上青蒿素的供应, 有效地降低青蒿素的价格,有利于控制疟疾在贫困国家的肆虐。

3 青蒿素化学合成保障

3.1 青蒿素化学合成途径

青蒿素是一个含过氧基团的倍半萜内酯化合物,过氧基以内型方式固定在两个四级碳上从而形成桥型结构，这一特殊结构的化学全合成极具挑战性。1983 年, 瑞士科学家Schmid 和Hofheinz[8]首次实现了青蒿素的化学全合成路线，总收率为4.9%。1986 年，周维善研究组[9]经13 步反应以5.6%的总收率得到青蒿素。此外，根据报道已有十几条化学合成路径从光学活性的倍半萜或单萜起始成功获得青蒿素，其中关键步骤为过氧基团的引入。2011和2012年，伍贻康研究组[79]和张万斌研究组[80]分别使用不同的非光照氧化条件引进过氧基团，以高收率获得了青蒿素。

青蒿素的化学合成根据起始原料的复杂程度可以划分为化学全合成和半合成两种类型。第一类化学全合成，总体路线长且反应总收率较低。同时，大都需用到光化学反应条件，部分反应需要低温条件进行，其设备要求高，难以实现工业化生产。第二类半合成，总体路线缩短且反应总收率大幅提高，但由于半合成起始原料结构复杂，具有一定的工业化难度。因此，目前以合成生物学技术制备的青蒿酸为原料，再通过无需光照的化学氧化反应合成青蒿素。该策略在前期研究基础上以较短的合成路线，温和、简便的反应条件实现青蒿素的高效人工合成，成为人工合成青蒿素工业化生产的首选方案。

3.2 影响青蒿素化学合成保障的主要因素

3.2.1 理论依据与实施效率

合理的青蒿素化学合成理论依据即合成路线的设计与探索，标志着合成路线的可行性，同时为进一步实现青蒿素化学合成工业化生产奠定坚实的基础。其次，化学合成路线的实施效率决定理论依据的可靠性，合成路线的缩短和青蒿素或重要中间产物收率的提升，有效降低工业化生产成本并增加收益。

第一阶段为化学全合成。（1）以香茅醛为原料。1996年周维善经13步反应，以香茅醛为原料完成青蒿素合成，虽然收率低于1%，但实现了青蒿素的立体选择性全合成[9]。2010 年Yadav 等[81]经过9 步反应完成光氧化反应合成青蒿素，但由于最后一步光氧化反应效率较低，总收率为5%。（2）以薄荷酮为原料。1992年Avery 等[82]以薄荷酮为原料，经10 步反应完成青蒿素全合成，最后采用一锅法经多步复杂的环化反应得到青蒿素，收率为5%。（3）以环己烯酮为原料。2012年Cook 等[83]通过串联反应，通过5 步简洁的合成青蒿素，总收率达到10%以上。其中以钼酸铵为催化分解得到单线态氧，氧化物中间体最终转化为青蒿素总收率为29-42%，最终达到几十克级别规模。后续又出现以异胡薄荷醇、柠檬烯、β-蒎烯等为原料的全合成路线，但青蒿素总收率都不高。

第二阶段为化学半合成。围绕以合成生物获得的青蒿酸为原料，即以青蒿素仿生合成为目的进行探索，实现合成生物与化学合成携手完成全合成的过程。1986 年Jung 等[84]尝试以青蒿酸为原料合成青蒿素，虽遗憾地没有获得青蒿素，但反应结果得到了重要代谢中间产物脱氧青蒿素5k，为研究青蒿素半合成奠定了基础。1989年，Ye等[85]使用重氮甲基化经多步反应最终得到青蒿素，总产率高达37%，是非常具有工业化价值的合成方法。此外，1992年Peter等[86]以青蒿酸或青蒿素B 半合成得到青蒿素。2011 年上海有机所伍贻康等[79]参考并优化Peter 的合成方法，使青蒿素产率达到近70%。2012年上海交通大学张万斌等[80]采用RuPHOX-Ru 为催化剂用于青蒿酸的不对称催化氢化反应，最终收率达到了60%，这一技术已完成青蒿素公斤级合成放大试验，并与企业合作并投入工业化生产。

3.2.2 技术条件和制备工艺

青蒿素化学合成中光化学反应是最关键的一步，光照条件增加了设备的复杂性和合成成本。这一苛刻的反应条件是阻碍青蒿素化学合成实现大规模工业化生产的一个重要因素。如果希望该光化学反应充分进行，只能以尽量小规模的方式进行，难以满足市场对青蒿素用量的需求。如果采用分步式工艺，所使用的化学反应罐规格虽然较大，却很难保证光线均匀照到反应罐内部，从而降低光化学反应的效率。赛诺菲通过设备改造使反应液经过一个管道，然后用光束照射玻璃管，但此举造成设备成本大大增加，该工艺也因为设备代价大、合成成本高等原因而停产[87]。可见，要实现青蒿素的大规模工业化生产，还需要探索非光照条件下的高效人工合成方法。其次，实验中青蒿素制备收率低，二氢青蒿酸反应选择性差导致产物纯化困难等问题，同样也是制约青蒿素化学合成发展的重要因素。

青蒿素的化学合成，可以通过新反应、新试剂和新路线，合成毫克级或克级的产物，并且市场现有的实验设备、工业设备非常成熟和完善。化学合成是通过人工设计的合成路线，以经典的有机反应进行，具有更强的可控性。青蒿素合成生物开发了由单糖制备青蒿酸的可产业化合成工艺，精确地完成每一步反应并保持几乎100%的立体选择性和区域选择性，但由青蒿酸形成过氧键合成青蒿素的步骤成为合成生物学的难点。化学合成方法则攻克这一难点，实现了由青蒿酸到青蒿素的高效化学合成工艺，从而打通了青蒿素人工合成的全产业链。合成生物学结合化学合成的方法是实现青蒿素大规模生产的一种有效生产模式，也将稳定或降低青蒿素的价格，成为生产青蒿素的重要供应来源之一。

4 结论和展望

本文从青蒿素天然产物生物合成、合成生物和化学合成的各个环节详述了青蒿素资源保障策略要点。青蒿素的全球年需求量约260 吨，中国提供约240 吨。目前，中国市场上最经济和主要获取青蒿素的方法是通过黄花蒿植物提取。随着全球每年对青蒿素及其衍生物的需求量逐渐增加，栽培黄花蒿药材成为目前市场应用最理想的保障策略。而当栽培的黄花蒿药材在产量、栽培品种以及提取工艺达到最高值限制时，合成生物学能在短时间内获得大量的青蒿酸，不受环境和土地的制约,能稳定世界市场上青蒿素的供应，有效地降低价格，利于控制疟疾在贫困国家的肆虐。通过结合合成生物学和化学合成的半合成能够获得大量的青蒿素，这一成熟的半合成体系是目前工业化生产青蒿素最常用的方法。通过栽培、合成生物学和化学合成多种方法的实施全面保障了青蒿素资源的来源，有利于青蒿素产业的标准化和可持续化，使黄花蒿资源和青蒿素的使用和安全得到保障，也为紫杉醇、长春碱、人参皂苷、丹参素、红景天苷、天麻素等天然产物的资源保障提供重要参考价值。