植物2,3-氧化鲨烯环化酶的研究进展＊

张 斌，梁苗苗，谭政委，孙俊聪，郭妍宏，薛哲勇＊＊

（1. 东北林业大学生命科学学院/植物天然活性物质的生物合成与利用重点实验室 哈尔滨 150040；2. 河南省农业科学院芝麻研究中心 郑州 450002；3. 中国科学院植物研究所 北京 100093）

三萜是一类结构多样的天然产物，具有抗肿瘤、抗炎、调节免疫等生理活性，也是许多植物中药的活性成分[1-8]。三萜类化合物都先经历2,3-氧化鲨烯（2,3-oxidosqualene）环化反应生成三萜骨架，催化这一关键步骤-环化反应的酶被称为2,3-氧化鲨烯环化酶（OSC）。目前从植物中通过分离提取已鉴定到超过120 种三萜骨架，通过酵母、烟草异源表达体系鉴定超过150 种OSCs，但只覆盖了其中51 种三萜骨架，仍有大量植物三萜类成分的OSCs尚未鉴定[7]。

目前,模式植物拟南芥和水稻中的OSC 已有较全面的研究，已有研究报道了拟南芥基因组中挖掘到13个OSC 基因[9]，异源表达鉴定了多个三萜产物，包括环阿屯醇（cycloartenol），羊毛甾醇（lanosterol），β-香树素（β-amyrin），marneral，thalianol 以及arabidiol 等[9]。水稻中有12个OSC基因[10]，异源表达分析其产物包括β-香树素（β-amyrin），帕克醇（parkeol），异乔木萜醇（isoarborinol）等[9]。OSC 酶的功能鉴定主要以酿酒酵母和本氏烟草为异源表达体系，结合GC-MS 或LCMS以及NMR 对代谢产物进行检测和鉴定。基于晶体结构解析、同源建模、定点突变对OSC 的催化机制和活性改造有了深入的研究[11]。随着测序技术发展，越来越多植物OSCs 将被发掘，以AlphaFold 为代表的AI技术对OSCs 结构进行更精准的预测[12-13]，对催化机制解析和新功能突变体酶的发现有指导意义。

1 植物OSC异源表达体系

1.1 酵母体系异源表达植物OSC

利用酵母体系异源表达植物OSC 具有多种优势，比如酵母作为生物学研究的模式生物，转基因操作相对容易，且酵母生长迅速，实验周期较短，此外，酵母本身能够产生OSC 的底物—2,3-氧化鲨烯[11]。用羊毛甾醇缺陷型的酵母（Gil77）进行蛋白表达，该酶利用酵母内源的2,3-氧化鲨烯可以合成目的产物，并用薄层层析（TLC）方法分析环化产物。这其中的典型例子是模式植物拟南芥，通过全基因组的分析，拟南芥中共有13个OSCs基因，其中大多数为多功能酶，比较典型的是At4g15370/BARS1/PEN2基因，它编码baruol 合酶，在酵母异源表达体系中催化产生90%的baruol 及22 种含量极低的副产物[22]。毕赤酵母（Pichia pastoris）在完全培养基YPD 生长，该体系已经被用来成功地分析来自Euphorbia tirucallia的β-香树素合酶的功能[23]。同样的酵母体系成功地分析了水稻OsPS和OsISO的功能，并显示出它们分别能产生的帕克醇和异乔木萜醇三萜化合物[24]。

但酵母作为异源表达植物OSC 体系亦存在不足，密码子偏好性问题便是其一。Sun 等[14]在研究水稻OsOSC6时发现该基因在水稻多组织表达，但直接克隆转化到酵母后，并没有检测到转化酵母的产物有改变，之后Sun 等利用基因全合成的方法合成了蛋白序列与OsOSC6一致，而密码子偏好酵母的SnOsOSC6，克隆转化酵母后，证实其有能够合成β-香树素和α-香树素。

1.2 烟草体系异源表达植物OSC

近年来利用本氏烟草体系研究OSC 催化功能得到了迅速地发展，烟草体系对于多数植物源OSC 都可以验证功能，无需密码子优化，且烟草可内源合成OSC底物——2,3-氧化鲨烯，无需外源添加。

利用该异源表达体系成功鉴定了苹果（Malus domestica）中一个编码α-amyrin 为主要产物的不寻常的三萜合酶[16]。随后，来自苹果MdOSC4和MdOSC5用本氏烟草瞬时表达表明均是多功能的OSC 酶，MdOSC4合成germanicol，β-香树素和羽扇豆醇，MdOSC5合成羽扇豆醇和β-香树素[17]。欧洲山芥（Barbarea Vulgaris）两个OSC 酶BvLUP2和BvLUP5分别合成羽扇豆醇、α-香树素和β-香树素的混合物[18]。本氏烟草体系在研究新的OSC 酶功能方面也得到了验证，OsONS1催化2,3;22,23-二氧化鲨烯产生αonocerin[19]，与在Gil77 酵母中产物一致。以上研究表明，本氏烟草的瞬时体系在OSC 酶功能鉴定方面和传统的酵母体系一样有效，并且更加便捷[9]。

对三萜下游代谢途径进行解析需组合不同的候选OSC、细胞色素P450酶、糖基转移酶等，将多个候选基因组合整合到一个载体上费时费力，而烟草体系可以混合不同的农杆菌同时侵染烟草叶片，无需构建多元载体，极大简化了实验操作[15]。

2 OSC序列克隆和功能鉴定

最先是从豌豆（Pisum sativum）中纯化得到的β-香树素合酶和环阿屯醇合酶，他们的分子量大小分别是35KD 和55KD[20]，但所获得的酶量不足以用于氨基酸序列的分析，人们只能测定其首尾序列。用反向遗传学的方法，可从真菌和动物中获得羊毛甾醇合酶的cDNA，例如用这种方法已获得鼠的羊毛甾醇合酶cDNA[21]。将拟南芥的cDNA 转化到酵母细胞中，经过产物的分析，鉴定了植物中的第一个环阿屯醇合成酶基因[22]。随后的研究者根据其保守序列，利用PCR 的方法克隆了大量的植物OSC基因。

Kushiro 等利用同源克隆的方法从人参根中克隆出来β-香树素合酶编码基因，β-香树素是重要的中药活性物质齐墩果烷型人参皂苷的合成前体[23]，随后在其他双子叶植物中β-香树素合酶基因也相继被克隆出来[24-33]，这是迄今为止发现植物中最大的一类三萜合酶基因（图1）；在单子叶植物中燕麦和水稻中也克隆到了β-香树素合酶基因[14,34]，但进化树分析表明，单子叶和双子叶植物中的β-香树素合酶基因进化起源不同。在燕麦中，β-香树素合酶是燕麦根中积累的抑菌类物质燕麦苷合成途径中的关键酶，它与燕麦苷合成途径中至少有三个不同功能的基因形成一个基因簇，这种不具有序列同源性、对最终产物有不同作用的基因形成基因簇在植物次生代谢特别是三萜类化合物的形成途径中的报道越来越多，关于基因簇的形成和调控机制近几年来也成了研究的热点[33,37-42]。

植物中另一类重要的OSCs 是羽扇豆醇合酶（lupeol synthases）（图1）催化2,3-氧化鲨烯环化生成五环三萜羽扇豆醇，最早从橄榄（Olea europaea）和（Taraxacum officinale）中克隆得到[43]；在其他植物白桦树（Betula platyphylla）、甘草（Glycyrrhiza glabra）、百脉根 （Lotusjaponicus）和木榄（Bruguiera gymnorrhiza）[30,44-45]也相继克隆到了羽扇豆醇合酶基因，在这些植物中克隆到的羽扇豆醇合酶都是单功能酶，只生成单一的产物羽扇豆醇；同源性在74-81%之间[46]；而在拟南芥（Arabidopsis thaliana）和蓖麻（Ricinus communis）中克隆到了产物以羽扇豆醇为主并有其他含量较少的副产物的多功能羽扇豆醇合酶[47-51]。迄今为止，大多数植物中的的OSCs 基因是通过同源克隆得到的，总数超过150 个[9]，主要是β-香树素合酶和羽扇豆醇合酶基因。

图1 2,3-氧化鲨烯环化酶（OSC）进化分析

3 植物OSC基因的进化

在真核生物中，甾醇（Steriods）如胆固醇作为细胞膜的组成成分，在稳定细胞膜的结构及调节细胞膜的通透性等方面起着重要作用；而在原核生物中，藿烷类（hopanoid）三萜作为细胞膜的组成成分在改善细胞膜的强度和刚度上起着重要作用[52-53]。藿烷类三萜和甾醇的合成都起始于前体鲨烯（Squlene），鲨烯何伯烯环化酶（SHC）能够将鲨烯环化成何帕烯（hopene）进而经过反应生成hopanoid，而在动植物和真菌中不同的OSCs 催化生成各种甾醇前体。Bode 等从可以产生甾醇的粘细菌Stigmatella aurantiaca克隆到第一个细菌环阿屯醇合酶基因，同时他们对Nannocystis excedens的化合物分析中也检测到了羊毛甾醇的存在，序列分析结构显示细菌中环阿屯醇合酶（CAS）的氨基酸序列与植物中的CAS 有37%-44%的相似性，与细菌SHC有26%的相似性，据此推测该细菌中CAS 可能由SHC进化而来，继而进化成高等植物中的CAS[54]。Lamb 等人从甲烷利用菌Methylococcus capsulatus中同时克隆了鲨烯单加氧酶（squalene monooxygenase）基因和羊毛甾醇合成酶基因（LSS），并利用大肠杆菌异源表达体系对这两个酶的功能进行了体外验证[55]。但已有的研究表明，在少数高等植物和一部分蕨类植物、少数苔藓类和真菌中有也hopanoid类三萜的存在[53,56]，这表明某些植物基因组中中也许同时有羊毛甾醇和藿烷类三萜合成酶基因的的存在，Shinozaki 等[57]首次从蕨类植物Adiantum capillus-veneris中克隆了鲨烯合酶同源基因ACH（22-hydroxyhopane synthase）和氧化鲨烯合酶同源基因ACX（cycloartenol synthase），氨基酸序列进化树分析也表明ACH 与细菌的SHC 聚为一类，而ACX 与高等植物的CAS 聚为一类[57]，该研究进一步表明植物中的OSC有可能由细菌中的SHC进化而来。

对植物基因组分析发现，低等植物如莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）、小立碗藓（Physcomitrella patens）及 蕨 类 植 物 如Adiantum capillus-veneris和Polypodiodes niponica只有一个OSC 基因，编码环阿屯醇合酶催化产生环阿屯醇，是植物生长所必需的[58]。而高等植物基因组中往往含有多个OSC 基因，对植物中OSCs 基因的进化分析表明，植物中OSCs 基因可能来自于同一个祖先CAS 基因[17,46]。Xue 等人利用已知的所有植物OSCs 共101 个基因进行了系统性进化分析，结果表明高等植物中的OSCs基因起源于一个CAS祖先，OSCs基因家族在进化过程中发生了两次古老的复制事件，一次是在单子叶和双子叶植物分化之前，经过基因复制形成了两个原始的OSC 基因：原环阿屯醇合酶（ancestral cycloartenol synthase，ACS）基因和原类羊毛甾醇合酶（ancestral lanosterol synthase-like，ALSL）基因，在单子叶植物从双子叶植物分化出来之后，ACS 基因经过多次复制扩张形成了现在单子叶植物中OSCs 基因，另一次古老的复制事件是ALSL 基因在单子叶和双子叶植物分化之前又发生了一次复制，原始的LSS基因在多数双子叶植物中保留了下来但在单子叶植物中丢失，而复制的ALSL 基因拷贝进化形成了现在双子叶植物中的OSCs 基因。同时对进化树的不同分支进行选择压力检测发现，不同分支的OSCs基因在进化过程中受到的选择压力明显不同，CAS 和LSS 和LUS 基因受到了净化选择的作用，而其中大多数OSCs 基因受到了正向选择的作用，这加快了重复基因获得新功能的速度。因此，OSCs基因家族的扩增及功能多样性由全基因组倍增、局部串联复制等形成的多拷贝基因在不同选择压力下获得不同功能的结果[24]。

4 OSC 酶结构和催化机制的研究进展

4.1 OSC基因结构和酶结构

一直以来，科学家们比较感兴趣的是为什么数量不多的OSCs 能催化产生结构如此丰富多样的产物，其中一种假设是这些OSCs 基因的序列差异会很大，核酸序列分析表明，目前发现的OSCs 基因外显子数量差别不大，大多数包含18 个外显子，除了第一个和最后一个外显子序列差异大，其它相对应位置的外显子大小比较一致，序列也高度保守，但内含子序列变化 很 大 。 目 前 嗜 热 球 菌（Alicyclobacillus acidocaldarius） 的 鲨 烯 环 化 酶（Squalenehopenecyclase，AaSHC）[59]和人类（Homo sapiens）的羊毛甾醇合成酶（hLSS）[50]的晶体结构已经解析。但是植物OSC 属于膜蛋白且分子量较大，难以获得晶体结构，到现在为止，仍没有植物OSC 晶体结构的报道。OSC是一类较为保守的酶家族，蛋白序列相似度高，目前对植物OSC 的研究主要通过同源建模及点突变对催化机制进行研究[59-60]（图2）。

图2 hLSS的三维结构和催化的基本过程

来自于嗜热球菌的AaSHC，催化角鲨烯环化为何帕烯，将其基因在大肠杆菌表达（Escherichia coli）后，通过阴离子交换色谱和凝胶过滤法纯化蛋白，最终得到分辨率为2.9Å 的蛋白晶体，AaSHC 为同源二聚体蛋白，为膜单侧结合蛋白，但并不穿透膜双分子层，每个单体的长度为631 个氨基酸，有两个结构域，形似“哑铃状”，分别用Domain1和Domain2表示，Domain1是一个由两个α6-α6 组成的同心环状螺旋组成的桶状结构域，Domain2是一个α-α螺旋桶状结构域，这两个结构由loop 环连接形成一个β 结构的空腔，在这两个桶装螺旋结构域外有8 个QW 基序，它们具有堆叠的Gln和Trp 侧链，其中有7 个具有几乎相同的构象，通过氢键作用将外部的螺旋结构连接起来起到稳定蛋白结构的作用，同时还有一个非极性的通道便于底物细胞膜进入到β 结构的空腔中的催化活性中心区域进行反应。

将人类的羊毛甾醇合酶（hLSS）基因在酵母（Pichia pastoris）中表达，通过金属螯合色谱和凝胶过滤法纯化蛋白，最终获得了分辨率为2.1Å 的蛋白晶体。晶体结构解析发现，hLSS的结构与AaSHC的非常相似，也都是有两个α-α 螺旋桶装结构域，这两个结构域也由loop 环连接形成一个β 结构的空腔，但在桶状螺旋外围只有5 个保守的与AaSHC 中构象相同的QW 基序，但同样起着稳定蛋白结构的作用，另外，hLSS 的N 端区域多了一个填充于两个结构域之间的区域，这段区域在维持蛋白构象和方向上起着重要作用，hLSS 最大的活性位点口袋位于Domain1 和Domain2 之间，hLSS 是一类膜单侧结合蛋白，通过Domain2中的部分区域附着于膜的一侧，Domain2与膜结合部分含有一个直径为25Å 的平面及底物进入活性位点的通道，该通道允许底物2,3-氧化鲨烯进入疏水活性位点，但该通道与活性口袋之间被一收缩位点严格分开[59]，通过改变Tyr237、Cys233 和Ile524 等氨基酸侧链的构象或者对516-524 及697-699 两个loop 环重排可以形成底物通道。根据OSC 和0.8%n-辛基-D-β-葡萄糖苷（β-OG）膜重结晶衍射分析，β-OG 的葡萄糖头部基团和OSC 的膜结构域平行排列，而β-OG 的辛基和双分子层的脂肪酸平行。例如OSC/LAS的疏水活性中心，Asp455、Cys456 和Cys533 等残基提供了极性帽子，有利于羊毛甾醇3 位氢键的形成，在A、B 环形成之后，Phe44、Tyr503 和Trp581 等残基通过阳离子-π 相互作用稳定C6 和C10 的阳离子。OSC 中的保守基序DCTAE决定了底物特异性，如果把鲨烯环化酶SC（squalene-hopene cyclase）保守基序DDTAV 变为DCTAE，SC也可以结合2,3-氧化鲨烯。

4.2 OSCs催化基本过程的推测

化学家们以OSC 催化产物的空间构象和化学反应基本原理为依据推测其催化的基本过程：①酶与底物的结合，底物的预折叠；②底物环氧基团质子化，环化反应起始；③各个环的形成；④在环骨架上发生一系列质子转移和甲基重排反应；⑤去质子化或捕获一个水分子形成最终产物[61]（图2）。底物的预折叠对环化反应的起始至关重要，同时决定了环化产物是CC-C 还是C-B-C 构型。OSC 产物多样性主要是由反应过程中一系列具有严格构象的部分环化的中间阳离子分子与酶催化活性中心的蛋白结构之间的相互作用决定的。

4.3 OSCs催化功能的关键氨基酸

目前对于LSS 的催化反应路径研究得较为透彻，为了研究羊毛甾醇形成的环化机制，研究者进行了许多针对LSS 活性中心氨基酸的定点突变实验。Tyr510Ala 突变后可以生成羊毛甾醇，而Tyr510Lys 和Tyr510Trp 突变后不能生成羊毛甾醇，说明Tyr510 参与单环到四环产物的生成[40,62]。有实验证明His234 和Tyr510之间的氢键相互作用能够稳定三环C14阳离子和C20 阳离子[63-64]；Phe445 能够稳定C14 阳离子，影响去质子化[65]；Trp232 对D 环形成起重要作用[66]；Tyr99有稳定B 环构象和C14 阳离子、形成C 环的作用[67]；Phe699 稳定C17 阳离子之间产物[68]；Cys703 不仅稳定C-B 构象C8 阳离子，还可以与Phe699 相互作用[69]；Ile705 影响羊毛甾醇C 环和D 环形成[70]；Tyr707可能影响C-B 构象C8 阳离子和lanosteryl C8/C9 阳离子的稳定[58]。

环阿屯醇和羊毛甾醇有相似的结构且都是C-BC 构型，许多环阿屯醇合酶（CAS）的定点突变实验也证明突变后的CAS 可以生成羊毛甾醇[29,71-74]，为LSS 从CAS 进化而来的观点提供了依据[75]。在β-香树素合酶中Phe728 影响D 环和E 环形成，Phe474 通过π 电子相互作用和空间位阻效应影响底物折叠[76-77]。Salmon等发现燕麦中的β-香树素合酶Ser728Phe突变会导致催化产物由五环β-香树素变为四环达玛烯二醇II（Dammarenediol-Ⅱ），且突变后的β-香树素合酶的底物特异性发生了变化，能够同时催化2,3-氧化鲨烯和2,3;22,23-二氧化鲨烯[78]。Banta 等使用大肠杆菌异源甾醇表达系统证明了细菌羊毛甾醇合酶中的四个氨基酸残基的取代使得除了四环甾醇之外还能合成五环脂肪醇[79]。

Xue[80]鉴定出粳稻OsPS 合成C-B-C 构象的四环三萜帕克醇，籼稻和野生稻OsOS 合成C-sC-C 构象的五环三萜籼稻醇以及12 种副产物。利用分子进化分析和蛋白结构模拟等方法从34 个稻属植物的46 个多态位点中鉴别出3个影响产物构象和结构变化的关键氨基酸位点。而且这三个氨基酸残基影响第四个氨基酸残基Tyr257 侧链的空间方向，从而决定了产物是C-B-C构象的四环三萜帕克醇还是籼稻OsOS合成CsC-C 构象的五环三萜籼稻醇[80]。因此，一些非直接作用氨基酸残基通过影响直接作用氨基酸残基的构象，可能引起酶功能的转换。

5 小结与展望

5.1 新颖功能OSC酶的挖掘

虽然通过分离提取植物鉴定到的三萜骨架超过120 种，但目前进行过功能验证的OSC 仅覆盖了其中的51 种三萜骨架[7]，仍有大量三萜骨架不清楚其OSC序列，这限制了三萜的异源生产和更广泛的应用。随着二代及三代测序技术的发展，提高了测序读长和通量，已经有数十个药用植物基因组完成了全基因组测序及组装工作，未来会有越来越多的药用植物基因组被报道。从测序基因组中挖掘新的三萜合酶，利用酵母和烟草异源表达体系，将有更多产生新骨架的OSC酶被鉴定。

5.2 OSC酶催化机制研究

OSC催化线性底物2,3-氧化鲨烯生成多环三萜产物是自然界中最复杂的酶级联反应之一，2,3-氧化鲨烯经过底物预折叠、环氧质子化、环形成、D 环扩张、E环形成、质子和甲基转移、脱质子或水合生成最终三萜产物[81]。已有研究利用同源建模及定点突变对人羊毛甾醇及β-香树素等三萜合酶的环化机制进行研究，但是其它三萜骨架类型比如大戟烷、甘遂烷、木栓烷等的环化机制还少有报道，可能是因为相关类型三萜合酶还少有发现。近年来发展的Alphafold 2基于深度学习蛋白质折叠过程从头预测蛋白空间结构，比同源建模预测精度更高，未来会成为酶催化机制研究的有力工具[12-13]。

5.3 异源表达体系

酵母是目前应用最广泛的真核表达系统，但植物源基因在微生物体内蛋白表达普遍较低，可能需要进行密码子优化才能在酵母底盘成功表达。烟草在次生代谢合成途径和蛋白的翻译后修饰上与候选基因的来源植物具有更多的相似性，因此在植物蛋白的异源表达上具有一定的优势。但由于底盘细胞自身复杂的代谢流，需要进一步通过优化整个体系，比如在酵母中敲低内源性的固醇代谢途径，在烟草中过表达上游限速酶—3-羟甲基戊二酰辅酶A 还原酶，进而提高目的产物的产量便于检测。