刺五加提取物对人神经细胞SH-SY5Y氧糖剥夺再灌注损伤的保护作用研究＊

王文杰，路娇娇，马凯丰，王凤格，马 擎，华 欣

（东北林业大学生命科学学院 哈尔滨 150006）

1 前言

脑卒中（Stroke）是危害人类生命健康的三大疾病之一，该疾病由颅内血液循环受阻引起，导致脑组织损伤及功能失常[1]。脑卒中分为缺血性和出血性两类，其中，临床上以缺血性脑卒中最为常见[2]。目前，缺血性脑卒中的治疗手段主要是包括溶栓及机械取栓在内的血管再通，但血管再通后血液中氧、糖含量的瞬间升高，会破坏缺血时大脑通过侧支循环趋向建立的新平衡，进而引发对脑组织的二次损伤，即脑缺血/再灌注损伤，这一损伤是脑缺血病理和治疗过程中至关重要的环节[3-4]。因此，寻找、开发能够降低脑缺血/再灌注损伤的药物对治疗缺血性脑卒中来说意义重大。

目前，应对脑缺血再灌注损伤的手段主要是使用神经保护剂，包括:抗氧化药物依达拉奉，依达拉奉能有效减少缺血区域氧自由基含量，抑制神经细胞凋亡，但其会导致肝肾功能异常、皮疹等不良反应；抑制神经兴奋毒性药物如N-甲基-D-天冬氨酸受体阻断剂等，存在脑保护作用有限且不良反应严重等问题；其他药物，如抗炎药物、神经生长因子等[5-6]。此外，多靶点药物丁基苯酞是一种芹菜提取物，是我国第三个自主产权化学药物，能够改善能量代谢、减轻脑缺血再灌注后神经损伤，丁基苯酞的发现，提示了天然产物治疗脑缺血再灌注损伤有巨大潜力[7-8]。然而目前治疗脑缺血再灌注损伤仍存在药物稀少、大部分药物副作用严重等问题。

刺五加（Acanthopanax senticosus( Rupr. Maxim.)Harms）是一种历史悠久、应用广泛的中药材，主要分布在我国东北、河北、山西等地。《名医别录》认为刺五加具有“补中，益精，坚筋骨，强意志”等功效，将其视为补气安神的良药[9]。多项研究表明刺五加含有多种活性成分，包括萜类、黄酮类、皂苷类、多糖类、香豆素类、木脂素类等[10]。现代药理学研究表明，刺五加药材及相关制剂对缺血性脑卒中有一定的治疗效果，例如刺五加注射液（主成分为黄酮类化合物），能够促进神经干细胞生长分化及增殖、参与调节中枢神经系统的兴奋和抑制过程、抑制神经细胞凋亡；刺五加叶皂苷等皂苷类化合物能够抗氧化、清除一氧化氮（NO）、抑制炎症反应[11-12]。虽然针对刺五加药理的相关研究日益增多，但其缓解缺血性脑卒中导致的神经损伤的成分及机制仍未被探明。

目前，缺血性脑卒中的发病机制仍不完全清晰，其中公认的相关机制有细胞凋亡、氧化应激、炎症反应、能量代谢紊乱等[13]。本研究通过体外建立SHSY5Y 细胞的氧糖剥夺再灌注（Oxygen and Glucose Deprivation/Reperfusion，OGD/R）模型来模拟脑缺血/再灌注过程，发现一种刺五加提取物可以减轻SH-SY5Y细胞氧糖剥夺再灌注后的损伤，并通过MTT 法检测细胞活力、流式细胞术检测凋亡率、荧光显微镜检测活性氧水平、检测胞内抗氧化酶活力及脂质氧化产物、检测胞内ATP 水平等手段，证实了其通过抑制氧化应激、细胞凋亡和保护线粒体功能来实现对SH-SY5Y细胞的保护作用。

2 实验材料

2.1 细胞与试剂

人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞株（中科院上海细胞库）、刺五加中药饮片（黑龙江德顺长中药饮片有限公司，用药部位为刺五加的根和根茎，经东北林业大学药用植物分类学专家郑宝江副教授鉴定为正品）、DMEM/F12 培养基（Hyclone, SH30023.01）、DMEM 无糖培养基（Procell, PM150271）、胎牛血清（Gibco,1099141）、青-链霉素溶液（Hyclone,SV30010）、0.25%胰蛋白酶（Gibco, 25200072）、PBS 磷酸盐缓冲溶液（Hyclone，SH30256）、MTT（索莱宝, M8180）、95%氮气+5%二氧化碳混合气体（哈尔滨卿华气体）、活性氧检测试剂盒(南京建成生物公司，E004-1-1)、Annexin V-PI 细胞凋亡检测试剂盒（江苏凯基生物公司，KGA106）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活性检测试剂盒（南京建成生物公司，A001-3-2）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）检测试剂盒（南京建成生物公司，A001-4-1）、BCA 蛋白定量试剂盒（索莱宝，PC0020）。

2.2 仪器

二氧化碳恒温培养箱（德国宾得）、超净工作台（上海博迅）、多功能酶标仪（瑞士Tecan Spark）、普通光学显微镜（天津微仪）、荧光显微镜（日本Olympus）、流式细胞仪（美国贝克曼）、缺氧密封小室（加拿大Steamcell）、电泳仪（美国BIO RAD）。

3 实验方法

3.1 样品制备

将刺五加饮片粉碎成粉，加15倍体积80%的乙醇溶液并超声，然后进行抽滤并收集滤液，将滤渣再次用15 倍无水乙醇超声提取，抽滤后收集滤液，滤渣再次重复上述操作。合并三次抽滤得到的滤液，旋干得到刺五加粗提物浸膏。用蒸馏水溶解刺五加粗提物浸膏，再依次用等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，最后将水相冻干得到刺五加提取物，产率为2.6%。

3.2 细胞培养

将细胞复苏后，用含10%胎牛血清（FBS）和1%青链霉素双抗的DMEM/F12 培养基重悬细胞，并接种于细胞培养瓶中，置于培养箱在37°C、5% CO2条件下培养。两次传代确认细胞状态后，用于构造损伤模型。

3.3 SH-SY5Y细胞氧糖剥夺再灌注模型建立

取对数期细胞接种于孔板中，培养24 h 后，用无糖DMEM 培养基清洗细胞，并换用无糖培养基，通以95%氮气+5%二氧化碳混合气体，在缺氧条件下培养6 h，然后再灌注恢复正常氧糖水平12 h。

3.4 实验分组及给药

SH-SY5Y 细胞在DMEM/F12 培养基内培养12 h后，分为5 组给药，分别为：空白组（Natural Control，NC），模型组（缺氧6 h，再灌注12 h），阳性对照组（80 μM 依达拉奉Edaravone+氧糖剥夺再灌注）、刺五加提取物中剂量组（500 μg·mL-1+氧糖剥夺再灌注）、刺五加提取物高剂量组（1000 μg·mL-1+氧糖剥夺再灌注）。各给药组需在药物孵育12 h后进行氧糖剥夺再灌注。

3.5 细胞存活率测定

利用MTT 法进行细胞存活率测定。按8000 个/孔的密度将对数期细胞接种于96孔板内，12 h后分别加入阳性对照药物依达拉奉和不同浓度的刺五加提取物孵育12 h，缺氧缺糖6 h 后再灌注12 h。每孔加100 μL 0.5 mg·mL-1的含MTT 培养基，于培养箱中避光孵育4 h后，用酶标仪测定各孔吸光度值OD490。

细胞存活率（%）= 样品组OD490/空白组OD490×100%

3.6 流式细胞术检测细胞凋亡

按2×105个/孔的密度将对数期细胞接种于6 孔板中，培养12 h后加不同浓度的样品孵育12 h，缺氧缺糖6 h后再灌注12 h。分别收集每组细胞，按试剂盒说明书染色处理后，用流式细胞仪进行检测。

3.7 荧光显微镜检测细胞内ROS

细胞处理同步骤3.6。按试剂盒说明书染色处理后，分别用荧光显微镜和酶标仪进行观察和定量。

3.8 细胞内SOD、MDA、ATP水平检测

细胞处理同步骤3.6。分别进行BCA 蛋白定量并严格按试剂盒步骤进行检测操作后，用多功能酶标仪进行SOD、MDA、ATP的含量检测。

3.9 数据统计方法

所有数据用GraphPad Prism 9和SPSS 24.0进行分析。通过单因素方差分析统计，P＞0.05 表示不具有显著性差异，0.01 ＜P＜0.05 表示具有显著性差异，P＜0.01表示具有极显著性差异。

4 结果

4.1 刺五加提取物对SH-SY5Y细胞活力的影响

利用MTT 法，对各处理组细胞进行了细胞活力检测，实验结果表明（图1），125 μg·mL-1，250 μg·mL-1，500 μg·mL-1，1000 μg·mL-1，2000 μg·mL-1，4000 μg·mL-1的刺五加提取物处理组的细胞活力（%）分别为100.00 ± 3.97，109.12 ± 2.36，110.20 ± 4.31，114.45 ±3.44，113.81 ± 2.36，108.50 ± 3.08，106.45 ± 5.90。细胞毒性以生物相容性国际标准（ISO10993-5）为根据进行判定可得，125 μg·mL-1，250 μg·mL-1，500 μg·mL-1，1000 μg·mL-1，2000 μg·mL-1，4000 μg·mL-1的刺五加提取物对SH-SY5Y细胞均无毒性（各实验组细胞活力均高于空白组细胞活力的70%）。而且，对比正常组，各刺五加提取物处理组的SH-SY5Y细胞活力均有提高，并在500 μg·mL-1和1000 μg·mL-1组显示出极显著性差异。

图1 不同浓度的刺五加提取物对SH-SY5Y细胞活力的影响

4.2 刺五加提取物能减轻氧糖剥夺再灌注（OGD/R）引起的SH-SY5Y细胞损伤

根据细胞毒性实验结果可知，刺五加提取物在低于4000 μg·mL-1浓度时对SH-SY5Y 细胞没有毒性。因此选取低于4000 μg·mL-1浓度的刺五加提取物进行了SH-SY5Y 细胞OGD/R 实验。实验结果显示，氧糖剥夺模型组的细胞活力是空白组的52%，且在普通光学显微镜下可观察到胞体回缩、树突结构减少甚至消失，证明造模成功（图2）。而阳性对照组、125 μg·mL-1、250 μg·mL-1、500 μg·mL-1、1000 μg·mL-1、2000 μg·mL-1、4000 μg·mL-1的刺五加提取物处理组的细胞活力（%）分别为68.10 ± 0.58，56.11 ± 0.58，67.18 ±3.69，68 ± 3.80，71.91 ± 7.19，67.31 ± 3.14，62.99 ±0.81。可以看出，当给药组刺五加提取物浓度低于1000 μg·mL-1时，细胞活力随样品浓度升高而上升，呈现出浓度依赖性，且细胞形态有所恢复，1000 μg·mL-1的刺五加提取物对比模型组细胞活力能提升20%，效果优于阳性对照组依达拉奉（80 μM）；刺五加提取物浓度高于1000 μg·mL-1时，细胞活力不再上升甚至回落，表明1000 μg·mL-1为减轻损伤的最佳浓度。故选择500 μg·mL-1和1000 μg·mL-1两个浓度作为后续实验给药浓度（图3）。

图2 各处理组普通光学显微镜观察

图3 不同浓度的刺五加提取物对OGD/R损伤下的SH-SY5Y细胞活力的影响

4.3 刺五加提取物能减轻OGD/R 引起的SH-SY5Y细胞凋亡

凋亡是公认的脑缺血再灌注损伤的重要机制之一，为了探究刺五加提取物与凋亡之间的关系，我们采用了流式细胞术检测了早期和晚期凋亡指标[14]。各处理组的Annexin V-PI 凋亡检测结果如图4 所示，散点图左上、右上、左下、右下部分分别代表处于坏死、晚凋、正常、早凋状态的细胞。实验结果表明，空白对照组、模型组、阳性对照组、500 μg·mL-1、1000 μg·mL-1的刺五加提取物处理组的凋亡率（%）分别为0.95 ±0.15，10.45 ± 1.34，1.46 ± 0.57，2.2 ± 0.51，1.47 ± 0.34。模型组处于凋亡时期（早凋+晚凋）的细胞和死细胞相较于空白组有明显增加。而刺五加提取物处理组（500 μg·mL-1和1000 μg·mL-1）对比模型组处于凋亡时期（早凋+晚凋）的细胞和死细胞有明显下降，显示出极显著性差异，说明刺五加能显著减轻OGD/R 引起的SH-SY5Y细胞凋亡。

图4 各处理组Annexin V-PI凋亡流式检测

4.4 刺五加提取物能减轻OGD/R 引起的SH-SY5Y细胞氧化应激

细胞内的活性氧（ROS）水平采用DCFH-DA（2,7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，活性氧探针）染色进行标记后的检测结果如图5所示，模型组、阳性对照组、500、1000 μg·mL-1的刺五加提取物处理组相对于空白对照组的荧光强度（%）分别为285.98 ± 4.36,184.44 ± 1.21, 200.18 ± 12.29, 185.96 ± 4.12。由此可见，模型组荧光强度明显高于空白组，氧糖剥夺损伤显著提高了细胞内的活性氧水平（P＜0.01）；而阳性对照（依达拉奉）组和刺五加提取物处理组荧光强度相较于模型组明显降低，1000 μg·mL-1刺五加提取物的效果优于500 μg·mL-1的刺五加提取物。除此之外，抗氧化酶SOD 活力检测和丙二醛MDA 含量测定实验结果显示（表1），模型组SOD 活力下降，抗氧化能力下降，同时MDA 升高即受到氧自由基攻击程度升高；而刺五加提取物处理组（500 μg·mL-1和1000 μg·mL-1）对比模型组，抗氧化酶SOD活力显著提高且胞内MDA含量下降，表明刺五加提取物能提高细胞抗氧化能力，并减轻细胞受氧自由基攻击程度。由此可见，刺五加提取物能减轻OGD/R引起的氧化应激。

表1 各处理组SOD活力及MDA含量

图5 各处理组ROS水平检测

4.5 刺五加提取物能保护SH-SY5Y细胞线粒体功能

ATP 是脑组织的能量来源，是维持脑细胞功能的重要物质。线粒体的有氧呼吸是ATP 产生途径，因此线粒体功能变化会导致ATP 含量的变化，ATP 的含量可体现线粒体功能的正常与否[15]。实验结果显示，空白对照组、模型组、阳性对照组、500 μg·mL-1、1000 μg·mL-1的刺五加提取物处理组的胞内ATP 含量分别为16.27 ± 0.18, 13.75 ± 0.10, 15.72 ± 0.35, 15.02 ±0.39, 15.50 ± 0.81 μmol·mg-1prot（图6）。模型组较于空白组ATP 含量显著降低，表明模型组线粒体功能失常。而刺五加提取物处理组（1000 μg·mL-1）对比模型组，ATP含量显著提高，表明1000 μg·mL-1的刺五加提取物可减轻氧糖剥夺损伤对SH-SY5Y 细胞线粒体功能的抑制作用。

图6 各处理组ATP含量检测

5 讨论

缺血性脑卒中的发生会造成供血受阻区域的脑细胞坏死，而围绕梗死核心的缺血半暗带的侧支循环使得该区域神经细胞损伤在一定程度上可逆，而血管再通后的再灌注会进一步损伤该区域神经细胞[16-17]，因此，保护该区域神经细胞、减轻脑缺血再灌注导致的神经细胞损伤，对于缺血性脑卒中治疗来说十分重要。

缺血半暗带区域的缺血再灌注损伤引起的细胞死亡主要以凋亡为主，区别于坏死的无序死亡，凋亡是对生理病理信号、环境变化或损伤产生的有序变化死亡过程[18]。因此有希望通过干预凋亡过程，来延缓或阻止凋亡细胞走向死亡。

SH-SY5Y 人神经母细胞瘤细胞系因其细胞形态、生理和生化功能与正常神经元相似，并且可传代培养，是研究神经元细胞凋亡的重要工具，被广泛应用于神经系统疾病发病机制和药物作用机制方面的研究[19]。因此本研究选用了SH-SY5Y 细胞进行氧糖剥夺再灌注模型的构建及后续研究。

中药材刺五加含有皂苷、黄酮、多糖、挥发油等多种物质，使其具有保护心脑血管、增强免疫、抗疲劳等活性，而刺五加的提取方法直接影响提取物的活性有无及高低。乙醇提取法加以超声辅助是中药材及天然产物提取的常用方法，该法制备的中药材提取物常具备较高药理活性[20-21]。因此本研究采用该法制备刺五加粗提物，并根据极性由小及大，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇对水溶后的粗提物进行了萃取，得到了石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相四种极性的粗提物组分。通过预实验发现，刺五加粗提物的水相组分对SH-SY5Y 细胞氧糖剥夺再灌注损伤的保护活性最高，因此选用刺五加粗提物的水相组分作为本研究的样品（即刺五加提取物）进行后续研究。根据极性分析，刺五加提取物中起保护作用的活性成分可能为皂苷类、生物碱类及黄酮的糖基缀合物。

本研究发现，刺五加提取物能显著降低OGD/R 实验中SH-SY5Y细胞的凋亡率及促凋亡蛋白的表达，表明刺五加提取物能减轻OGD/R 引起的SH-SY5Y 细胞凋亡。

氧化应激是脑缺血再灌注损伤级联机制中的重要环节。脑缺血再灌注会破坏细胞内原本的氧化还原动态平衡，胞内自由基含量远高于正常的生理需求量，与此同时，胞内抗氧化酶体系失常使得过量自由基无法被及时清除，导致氧化应激事件[22]。因此，本研究尝试对刺五加提取物是否能改善缺血再灌注过程中氧化应激进行了探究，结果发现，刺五加提取物能够显著提升胞内抗氧化酶SOD 活力、减少脂质过氧化物MDA 产生，降低活性氧水平，表明刺五加提取物具有一定的抗氧化能力，能够减轻OGD/R 引起的SHSY5Y细胞氧化应激损伤。

氧化应激会使线粒体功能失常，影响细胞能量代谢，进而加剧细胞损伤。本研究通过检测ATP 水平来探究刺五加提取物在OGD/R 条件下对线粒体功能的影响。结果显示，刺五加提取物能显著提升ATP 含量，表明刺五加提取物对OGD/R 条件下的线粒体有一定的保护作用。

上述研究结果显示，刺五加提取物可干预缺血级联反应的多个阶段。在缺血性脑卒中神经保护剂研究面临着大量单一靶点激活或抑制药物临床转化失败的困境下，有必要将一部分研究转向寻找多效、多靶点神经保护剂[23]。而王拥军等人进行的依达拉奉右莰醇作为神经保护剂治疗缺血性脑卒中的研究表明，依达拉奉作为自由基清除剂与右莰醇作为抗炎症药物的多靶点药物组合，能有效干预缺血级联反应多个阶段，阻止病理过程瀑布式发展，并在III 期临床试验中取得了积极的结果[24]，这也验证了进行多效、多靶点神经保护剂研究思路的合理性，同时为刺五加提取物的进一步研究提供了启示。

综上所述，本研究发现了一种刺五加提取物具有减轻SH-SY5Y细胞氧糖剥夺后再灌注损伤的作用，并证实其通过抑制氧化应激、保护线粒体功能和抑制细胞凋亡实现对神经细胞的保护作用。但其抑制氧化应激、保护线粒体功能和抑制细胞凋亡的具体通路及分子机制仍需要进一步探究，这也是我们课题接下来的一个重点研究方向。