C57BL/6和ICR品系小鼠在大脑中动脉栓塞（MCAO）模型中差异的研究＊

郑晓宇，宋文婷，李 磊，曹 慧，姚明江，刘建勋＊＊

（1. 中国中医科学院西苑医院基础医学研究所/北京市中药药理重点实验室 北京 100091；2. 北京中医药大学临床医学院西苑医院 北京 100029）

由于脑部血管阻塞而导致血液阻断或由于血管破裂导致血液无法流入脑组织，导致了一种急性脑血管疾病，即脑卒中。依据发病原因的不同又被分为了缺血性脑卒中和出血性脑卒中。其中，缺血性脑卒中已成为严重危害人类健康的疾病，具有较高的死亡率和致残率。现代医学认为，大脑需要持续不断获得氧，继而生成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），维持功能代谢的正常进行，一旦因各种原因导致脑缺血缺氧，会使细胞和神经发生损伤，产生感觉、运动及意识等功能障碍，甚至可能导致死亡。缺血性脑卒中最终还会导致神经凋亡、血脑屏障被破坏、脑水肿和出血性转化等结果[1-3]。

在基础医学研究中，为更好的贴近人类缺血性脑卒中的发病过程及偏瘫等症状，常采用大脑中动脉闭塞的模型来模拟大脑局灶性缺血的模型，较为常用方法为线栓法，此法因具有缺血和再灌注时间可控制、脑梗死部位可确定、制作方式可操作等原因而被广泛应用[4-5]，并在日益发展的过程中逐步成熟，目前已成为最为常见的脑缺血模型的制作方法。但在实验设计过程中，动物品系的选择往往不会被作为实验设计时首要的考虑因素，并且目前未见脑缺血模型与品系间差异相关的报道，但不同动物品系间往往存在一定的差异。本研究通过比较C57BL/6 和ICR 小鼠大脑中动脉闭塞后体重变化率、生存率、神经行为学评分、脑指数、脑含水量、脑梗死面积等方面，展示了在局灶性脑缺血模型中不同品系小鼠之间以上指标中的差别，并制作小鼠脑部血管铸型实验，为未来科研工作者们在模型制作中提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性C57BL/6 和ICR 小鼠各15 只，共32 只，SPF级，体质量20-24 g，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，许可证号SYXK（京）2015-0011。小鼠饲养于中国中医科学院西苑医院SPF 级实验动物中心，实验操作完全遵循该机构道德伦理学标准。动物设施室内温度23℃-25℃，相对湿度55%±10%。维持12h 光照/12h黑暗的昼夜节律。

1.2 主要试剂和仪器

戊巴比妥钠（北京化学试剂公司；批号：20190402）；1620A1 栓线（北京西浓科技有限公司；批号：20200509）；牙科模型树脂（Ⅱ型）（安阳市鹰牌齿科材料有限公司；批号：20180917）；牙科模型树脂（安阳市鹰牌齿科材料有限公司；批号：20180917）；邻苯二甲酸二丁酯（无锡市亚太联合化工有限公司；批号20181201）；氢氧化钾（天津市福晨化学试剂厂；批号：20170220）

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组

将C57BL/6 和ICR 小鼠分为4 组，分别为C57BL/6正常组、C57BL/6 模型组、ICR 正常组、ICR 模型组。本着减少动物伤害的原则，设C57BL/6 正常组和ICR 正常组为5 只，C57BL/6 模型组和ICR 模型组分别设10只。

1.3.2 局灶性脑缺血再灌注损伤模型（栓线法）

C57BL/6 和ICR 模型组小鼠进行大脑中动脉栓塞（MCAO）造模。0.5%戊巴比妥钠麻醉，颈部备毛、消毒，做正中切口，分离右侧颈总动脉（common carotid artery，CCA）、颈外动脉（external carotid artery，ECA）、颈内动脉（internal carotid artery，ICA），微动脉夹夹闭ICA，近心端结扎CCA、ECA、距CCA 分叉部2 mm 处剪口，将栓线插入到ICA，在CCA远心端轻系栓线。用眼科镊将线栓向脑部送入，线栓的线直径0.16 mm，头部直径0.20±0.01 mm，插入深度为9 mm（血管分叉处至线栓前端的距离）。待确定好插入深度后，系牢CCA远心端的结扎线，线栓插入的时间即为脑缺血的时间。在脑缺血90 min 时，用镊子缓慢拔出线栓约1 cm后剪断线栓，剩余少部分线拴留在CCA 中，以防止血管出血。同时血液可由willis环再次进入大脑中动脉，实现脑部血管再灌注。之后缝合动物伤口，回笼饲养，正常供应水和饲料，观察动物状态。小鼠脑内线栓走向如图1所示。

图1 小鼠脑内线栓走向示意图

C57BL/6 和ICR 正常组小鼠仅进行颈部血管分离操作，缝合伤口后，回笼饲养，正常供应水和饲料，观察动物状态。

1.3.3 复合Garcia神经评分

C57BL/6 和ICR 模型组小鼠分别于缺血后6h 和24h进行复合Garcia神经行为学评分，满分为21分，最低分为3分，评分全程在一块20 cm×30 cm的粗糙平板上进行。复合Garcia神经行为学评分标准[7]如下表1。

表1 复合Garcia神经行为学评分表

1.3.4 体重变化率测定

在小鼠术前和术后的24 h，分别用电子天平称得其体重，计算其体重变化率。体重变化率的计算方法为：体重变化率（%）=（术前体重-术后体重）/术前体重×100%

1.3.5 脑指数测定

在小鼠MCAO 术后24 h，接受0.5%戊巴比妥腹腔注射麻醉，迅速断头处死取前脑，用滤纸小心地吸掉小鼠前脑表面的脑脊液和血液，用电子天平称量得到整脑湿重（精确到0.001 g），脑指数的计算方法为：脑指数（%）=整脑湿重/小鼠体重×100%

1.3.6 脑含水量测定

在小鼠MCAO 术后24 h，接受0.5%戊巴比妥腹腔注射麻醉，迅速断头处死取前脑，取右半侧缺血侧大脑，轻轻用滤纸吸去表面的血液和脑脊液，置于已称重的培养皿中，用电子天平称湿重（精确到0.001 g），然后放入60℃的烘箱中烘烤72 h 至恒重，称其干重，计算脑组织含水量。脑含水量的计算方法为：脑含水量（%）=（湿重-干重）/湿重×100%。

1.3.7 脑梗死面积测定

在小鼠MCAO 术后24 h，接受0.5%戊巴比妥腹腔注射麻醉，迅速断头处死，取脑后及时沿冠状纵切成4片，脑片随即用0.2%TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）在37℃恒温下进行染色约20 min，拍摄脑片梗死灶分布情况照片，并用image pro plus 软件画出每个脑片的缺血面积和全脑片面积，计算脑梗死面积。脑梗死面积的计算方法为：脑梗死面积（%）=梗死面积/全脑片面积×100%。

1.3.8 观察动物生存率

截止到缺血后的24 h，观察C57BL/6 和ICR 模型组小鼠的生存率。生存率的计算方法为：生存率=存活只数/原始只数×100%。

1.4 脑部血管铸型

选择ICR小鼠进行脑部血管铸型。用生理盐水进行灌注，直至冲洗出的血水颜色变浅，肝脏变白，后用自凝牙托水（3.75 mL）、自凝牙托粉（2 g）、邻二甲基苯丙醛（1.5 mL）、红色颜料（0.2 g）混匀后从心尖注入小鼠体内。静置24h 后，剪掉多余的皮毛和组织，泡入4 mol·L-1的氢氧化钾溶液中约一周，即得到ICR 小鼠脑血管铸型。将得到的血管形态进行修剪，得到图。

1.5 统计学分析

以上数据结果采用SPSS 20.0 统计学软件进行分析。计量资料符合正态分布以均数±标准差（±s）表示，若各组数据均符合正态分布，则进行单因素ANOVA 分析，P＜0.05 为具有统计学差异，P＜0.01 为具有显著统计学差异。

2 实验结果

2.1 C57BL/6和ICR小鼠神经行为学数据比较

如图所示，C57BL/6 模型组小鼠脑缺血后6 h 和24 h的神经行为学评分显著低于与C57BL/6正常组小鼠，具有统计学差异（P＜0.01）；ICR 模型组小鼠脑缺血后6 h 和24 h 的神经行为学评分显著低于ICR 正常组小鼠，差异具有统计学意义（P＜0.01）；C57BL/6 模型组小鼠脑缺血后6 h 和24 h 的神经行为学评分低于ICR模型组小鼠，但差异并无统计学意义（图2）。

图2 C57BL/6和ICR小鼠缺血后6 h（a）和24 h（b）的神经行为学评分比较（±s）

2.2 C57BL/6和ICR小鼠体重差异数据比较

如图所示，C57BL/6 模型组小鼠的体重差异显著高于C57BL/6正常组小鼠，具有统计学差异（P＜0.01）；ICR 模型组小鼠的体重差异显著高于ICR 正常组小鼠，具有统计学差异（P＜0.01）；C57BL/6 模型组小鼠的体重差异显著高于ICR 模型组小鼠，差异具有统计学意义（P＜0.01）（图3）。

图3 C57BL/6和ICR小鼠术前和术后体重差异数据比较（±s）

2.3 C57BL/6和ICR小鼠脑指数数据比较

如图所示，C57BL/6 模型组小鼠的脑指数显著高于C57BL/6 正常组小鼠，具有统计学差异（P＜0.01）；ICR 模型组小鼠的脑指数显著高于ICR 正常组小鼠，具有统计学差异（P＜0.01）；C57BL/6 模型组小鼠的脑指数显著高于ICR 模型组小鼠，差异具有统计学意义（P＜0.05）（图4）。

图4 C57BL/6和ICR小鼠脑指数数据比较（±s）

2.4 C57BL/6和ICR小鼠脑含水量数据比较

如图所示，C57BL/6 模型组小鼠的脑含水量显著高于C57BL/6正常组小鼠，具有统计学差异（P＜0.01）；ICR 模型组小鼠的脑含水量显著高于ICR 正常组小鼠，具有统计学差异（P＜0.01）；C57BL/6 模型组小鼠的脑含水量显著高于ICR 模型组小鼠，差异具有统计学意义（P＜0.01）（图5）。

图5 C57BL/6和ICR小鼠脑含水量数据比较（±s）

2.5 C57BL/6和ICR小鼠脑梗死面积数据比较

如图所示，C57BL/6 模型组小鼠的脑梗死面积显著高于C57BL/6 正常组小鼠，具有统计学差异（P＜0.01）；ICR 模型组小鼠的脑梗死面积显著高于ICR 正常组小鼠，具有统计学差异（P＜0.01）；C57BL/6 模型组小鼠的脑梗死面积显著低于ICR 模型组小鼠，差异具有统计学意义（P＜0.01）。脑梗死情况如图6 所示，采用TCC 染色法检测小鼠脑梗死情况，发生脑梗死部分的脑组织呈现白色的梗死灶，C57BL/6 和ICR 的正常组小鼠无明显白色梗死灶，而C57BL/6 和ICR 模型组小鼠出现明显的白色梗死灶，可观察到C57BL/6 模型组小鼠的脑梗死区域较小，ICR 模型组小鼠的脑梗死面积与较C57BL/6模型组有所增加。脑梗死面积的数据统计如图7。

图6 C57BL/6和ICR小鼠局灶性脑梗死的梗死灶

图7 C57BL/6和ICR小鼠脑梗死面积数据比较（±s）

2.6 C57BL/6和ICR小鼠生存率数据比较

脑缺血24 h 后，发现C57BL/6 模型组小鼠因手术失败出血过多死亡1只，生存率为90.91%；ICR 模型组小鼠因造模过重死亡3只，生存率为72.72%。

2.7 ICR小鼠脑部血管铸型

ICR小鼠脑部血管铸型图如图8所示。

图8 ICR小鼠脑部血管铸型图

3 讨论

引发缺血性脑卒中的原因是脑部组织供血的动脉血流阻断或减少，无法为组织细胞提供氧糖。当缺血性脑卒中发生后，进一步会导致脑水肿等并发症，使颅内压增高使该局部脑组织被破坏，并难以恢复，临床上常会通过溶栓等方法恢复脑部血液重新灌流及脑组织脱水并降低颅压等方法进行治疗[7]，但缺血区域神经元死亡等难以恢复和逆转，是目前科研工作者们难以攻克的问题。

在临床上，恢复组织器官的血液灌流是及时治疗缺血性脑卒中的重要治疗方法，但在血液重新灌注及氧供时往往会发生加重组织损伤的现象，这种现象被称为脑缺血再灌注损伤，是进一步加重缺血性脑卒中、脑水肿、脑出血、神经元死亡等重要原因[8]，还会引起钙超载、兴奋性氨基酸的神经毒作用、内质网应激、线粒体损伤、炎性反应和调控凋亡基因等，最终导致难以逆转的脑损伤[9]。脑缺血再灌注通常被分为两个过程，一个是缺血的过程，一个是再灌注的过程。在缺血的过程中，动脉血流受阻导致细胞缺少红细胞供氧，并导致线粒体中电子传输链障碍，进而使线粒体中ATP 的产生减少，导致了钠钾泵功能障碍，致使细胞高渗性，终使细胞肿胀和破裂；在再灌注过程中，动脉中的缺血组织恢复血流和供氧，活性氧的产生会增加，进而会导致氧化应激、局部炎症反应和脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）损伤，其中又因为局部炎症反应和氧化应激反应，所以细胞结构破损加重，最后导致细胞死亡，造成不可逆的后果[10]。脑缺血再灌注损伤的病机十分复杂，目前已知的就已包含了多种途径与机制，它们之间又互相影响、互相关联，因此脑缺血再灌注损伤成为研究的热点与难点，该研究过程中所涉及到的大脑中动脉闭塞模型应用广泛，并在不断的摸索中逐渐成熟。

MCAO的模型制作全过程在上述实验方法中已详细说明。线栓在脑血管中的路线是从CCA 进入ICA，导致大脑中动脉中的血流降低或被阻断，一个较好的模型应从脑片的TTC 染色中得到面积较大的脑梗死面积，约占整个脑片面积的30%-50%。在这个过程中最为关键的是：保证线栓进入ACA 并阻断或降低对侧来的血流，且线栓不刺破血管。这是MCAO 制作的原理，也是确保最终实现脑缺血的关键所在。MCAO 模型制作的原理正是模仿了缺血性脑卒中的发病过程，通过栓线降低或阻滞大脑中动脉的血流量，使一侧大脑供血不足，并可以通过控制栓线在体内的时间进行再灌注，模仿临床上溶栓治疗的时间[11]。

在基础研究中，进行实验之前选择动物的种类是重要的一步，但往往是容易被忽略的地方。此前有研究发现，在MCAO 模型制备过程中，动物体重[12]、麻醉方式[13]、线栓插入深度[14-15]、线栓头段直径[16]等因素对大小鼠造模成功与否均具有十分关键的作用。但实验动物的品系选择往往会对实验数据产生一定的影响，因为不同品系之间的差异是确实存在的。比如李祥磊等[17]发现ICR、C57BL/6J 在学习方面存在差异三个品系中，C57BL/6J 小鼠自发活动低，旷场实验焦虑水平高，空间参考记忆优于ICR 小鼠；李腾飞[18]等发现C57BL/6 小鼠与ICR 小鼠在急性应急抑郁模型中的表现有一定差异，在小鼠自发活动量和对新奇环境的探索能力上，C57BL/6 小鼠不如ICR 小鼠，并且C57BL/6小鼠在急性应激刺激下更易产生行为绝望；刘芳[19]等在研究肥胖模型时发现C57BL/6J 模型组小鼠可形成良好肥胖模型，ICR 模型组小鼠与肥胖模型相关的指标，如体重、脂肪重量、Lee’s 指数、脂肪细胞横截面面积等，均不如C57BL/6J 小鼠变化明显；王瑞雪[20]等发现不同品系小鼠在禁食和（或）禁水状况下血糖变化趋势有所不同，表现为ICR 小鼠的血糖浓度低于C57BL/6J 小鼠，但ICR 小鼠的血糖变化幅度较C57BL/6J 小鼠更大。以上均结果提示，在各项实验研究中，需同时考虑不同品系动物之间的差异，从而选择合适的动物进行研究并对数据进行合理分析和解释。

本实验研究通过统计小鼠MCAO 模型制作前后体重、生存率、神经行为学评分、脑指数、脑含水量、脑梗死面积等方面的数据表明，采用相同的造模方法均可成功实现大脑中动脉栓塞模型，但在C57BL/6 与ICR 小鼠间存在较为显著的品系间差异。本研究通过比较C57BL/6 和ICR 两种不同品系的小鼠在MCAO 模型制作前后体重、生存率、神经行为学评分、脑指数、脑含水量、脑梗死面积等方面的差异，并进行了ICR小鼠脑部血管铸型实验，发现由于小鼠品系不同，使术后各指标之间也具有一定差异，这有可能是由于不同品系间小鼠脑部血管的细微差异所致。本研究结果可为未来研究者们选择MCAO 小鼠的模型制作的动物品系方面提供一定的参考。本文中所涉及到的实验流程如下图9所示。

图9 实验总体流程图