凉血通瘀方干预高血压大鼠急性脑出血模型对脑组织中差异miRNA表达的影响＊

李薇懿，李国春，魏乐心，钱 勤，郭晴晴，杨诗锦，杨晓娟，王鹏程，陈 杨

（南京中医药大学公共卫生系 南京 210023）

1 引言

脑出血（Intracerebral hemorrhage，ICH）是一种发生在脑组织和脑室内血管破裂所引起的急性危重疾病，约占全部脑卒中的10%-20%，病死率约为40%[1]，居急性脑血管疾病中的病死率最高位[2]。以往的研究表明，开颅血肿清除术是限制原发性脑损伤和降低脑出血后颅内压的有效治疗方法[3-5]，然而开颅血肿清除术对患者没有临床益处，长期预后没有改善，而且很少能够影响神经功能恢复[6]。因此，探索脑出血有效的治疗方法，成为亟待解决的问题。中医药诊治中风具有悠久的历史且形成了独特的病因病机理论。国医大师周仲瑛教授总结长期诊治脑出血的用药经验独创瘀热病机理论，在经方犀角地黄汤基础上加减化裁总结出效果显著的中药复方—凉血通瘀方（Liangxue Tongyu Prescription，LTP），临床应用中取得良好疗效[7]，虽然对其成分[8]、发挥抗炎及抗氧化作用[9]、减轻氧化应激[10]等方面做了诸多探索，但是凉血通瘀方治疗急性脑出血的作用机制尚未明确。

miRNA 是一类长度约22-24 个核苷酸的单链非编码RNA，大脑是最富含miRNA的组织之一，AICH实验模型证实miRNA 是重要的基因调节因子且与神经系统疾病息息相关[11]。它的主要作用是通过抑制靶基因的转录后翻译或者降解其mRNA，进而负性调控动植物细胞内的基因表达[12]。然而凉血通瘀方会影响哪些miRNA 表达，以及这些miRNA 在凉血通瘀方治疗急性脑出血病理过程及预后的调控机制，有待探究。

因此，本研究以自发性高血压大鼠（Spontaneously Hypertensive Rats，SHR）雄性为实验对象，凉血通瘀方灌胃给药后制作急性脑出血模型并采集脑组织样本，高通量测序得到急性脑出血大鼠脑组织中miRNA 表达变化，并对差异表达的miRNA 进行分析，包括靶基因预测、GO 功能富集分析、KEGG 信号通路的富集分析以及核心基因筛选。从miRNA 角度探讨LTP 干预高血压大鼠急性脑出血模型过程中可能的药效机制，以期为后续LTP研究提供方向和生物信息学依据。

2 研究思路与方法

将SHR 随机分为对照组（B）和实验组（C），C 组灌胃给药LTP，B 组则给予等体积生理盐水，构建脑出血模型后收集脑组织进行高通量测序，获得差异miRNA。首先对差异miRNA 进行靶基因预测，并对预测结果进行GO 功能分析、KEGG 通路富集和PPI 网络分析，进而筛选与LTP 调节ICH 相关的核心miRNA。研究思路流程图见图1。

图1 研究思路流程图

3 研究与分析

3.1 实验动物

清洁级雄性自发性高血压大鼠（SHR）20 只，体重为230-260 g，由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0006。饲养于南京中医药大学动物中心，用标准饲料喂养、自由饮水，动物房温度（22 ± 3）℃，湿度（55% ± 5%），12 h/12 h昼夜交替，环境安静，适应性饲养1周。动物实验方案通过了南京中医药大学伦理委员会批准，并严格遵循科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》相关规定。

3.2 实验药物

水牛角（批号：20170106）30 g、生地黄（批号：20161210）20 g、赤芍（批号：20170108）15 g、大黄（批号：20161201）10 g、地龙（批号：20170126）10 g、牡丹皮（批号：20151206）10 g、石菖蒲（批号：20170120）10 g、三七（批号：20151021）5 g，组方共110 g，购自于铜陵禾田中药饮片股份有限公司。药液制备方法：按照凉血通瘀方剂量比例称取饮片，混合打粉置于圆底烧瓶中，加6-8 倍量水浸泡0.5 h。电热套加热回流提取两次，每次约为1.5 h，收集挥发油。合并滤液，用旋转蒸发仪（80℃）浓缩药液，加入挥发油混匀，得到含有生药量1.0 g·mL-1的药液，4℃冰箱保存。

3.3 试剂及仪器

VII 型胶原酶（美国Sigma 公司，批号为BNN2146）；戊巴比妥钠（武汉易泰科技有限公司上海分公司，批号为57-33-0）；大鼠脑立体定位仪（上海玉研仪器有限公司）；多功能开颅钻（上海玉研仪器有限公司）；TJ-1A 型微量注射泵控制器（保定兰格恒流泵有限公司）；微量进样器（上海高鸽工贸有限公司）；RE-52A旋转蒸发仪（南京金正教学仪器有限公司）。

3.4 方法

3.4.1 动物分组及给药方法

采用完全随机化方法和SPSS22.0 软件（IBM SPSS Statistics 22.0）把实验动物随机分成对照组（B）以及实验组（C），每组10 只，随机化分组的种子数为（20171122）。适应性饲养1 周后连续灌胃5 天，每天1次，C 组给予凉血通瘀方灌胃（11.55 g·kg-1），B 组灌胃等体积的生理盐水。

3.4.2 动物造模

手术前12 h 禁食但不禁水，B 和C 组制作急性脑出血模型。脑出血模型制作顺序的随机化种子为（20121123）。参考文献[13]方法，用新鲜配制2%的戊巴比妥钠溶液45 mg/100 g 腹腔注射麻醉。将大鼠俯卧位固定于脑立体定位仪上，确保门齿钩平面比耳间线平面低2.4 mm。头部正中剃毛、碘伏消毒后切开，钝性分离骨膜，暴露前囟点。冠状缝前0.2 mm，前囟点右侧中线向右旁开3 mm，即是右侧尾状核。手持开颅钻稳步钻孔，微量进样器抽取稀释后的（0.05 U·L-1）VII 型胶原酶2ul，进针深度距离颅骨表面6 mm，10 min 匀速推注。留针10 min 后，缓慢匀速退出。医用骨蜡填补钻孔，用青霉素作为局部消炎，缝合切口并消毒。

3.4.3 样本收集

冷冻管液氮中预冷，术后12 h 迅速取出脑组织，用无酶水快速清洗脑组织表面并吸干液体，收集出血点周围脑组织约50-100 mg 左右小块，保存至预冷后的冷冻管，液氮速冻后并保存在-80℃冰箱，B 和C 组分别选取3个脑组织进行高通量测序。

3.4.4 上机测序

从脑组织样本中提取总RNA，并借助Nanodrop2000 对所提RNA 的浓度和纯度进行检测。起始时取5 μL 总RNA，浓度≥250 ng·mL-1，OD260/280介于1.8 和2.2 之间。去除核糖体RNA，根据说明书使用TruSeqTM 总RNA 库制备试剂盒（IIIumina）从纯化的RNA 中制备索引文库，利用金属离子，将RNA 随机断裂成200 bp 左右的小片段；依次为模板反转录合成cDNA，将反转录获得的cDNA 进行PCR 扩增，采用IIIumina Hiseq 4500测序平台进行测序。

3.4.5 miRNA靶基因预测

使用miRBase 数据库序列比对获得已知miRNA，使用miRDeep2 预测新miRNA。使用miRDeep2 软件对各样本中miRNA 的表达水平进行定量分析；使用基于负二项分布的DESeq2 软件对read counts 进行统计分析，基于一定的标准化处理和筛选条件获得比较组间表达差异的miRNA，默认参数：p-adjust ＜0.05 且|log2FC| ＞= 1，筛选差异表达显著的miRNA。本分析利用动物专用的靶基因预测软件miRanda（http://www.miranda.org/）对所有已知及新预测的miRNA 进行靶基因预测。

3.4.6 差异miRNA靶基因功能富集分析

采用软件Goatools（https://github.com/tanghaibao/GOatools）对基因集中的miRNA 靶基因进行GO 富集分析。利用GO 数据库，可以对基因和基因产物按照其参与的生物学过程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）及 细 胞 组 分（Cellular Component，CC）三个方面进行功能分类注释。通常情况下P 值（p-value）＜0.05 时，认为此GO 功能存在富集。

采用R 语言工具包clusterProfiler 工具包[14]。对基因集中的miRNA 靶基因进行KEGG Pathway 富集分析，预测miRNA 靶基因影响的信号通路。默认当P值＜0.05 时，认为此KEGG 通路存在显著富集情况，按照输入靶基因个数作图及分析。

3.4.7 核心靶基因筛选

把1243 个靶基因输入STRING（https://string-db.org/cgi/），靶基因间相互作用分数（minimum required interaction score）＞=0.900（最 高 置 信 区 间，highest confidence），PPI 富集p-value＜0.05。运用Cytoscape 软件的cytoHubba 插件从靶基因中用Maximal Clique Centrality（MCC）算法筛选出前10 名的关键靶基因，以作后续分析。

3.5 结果

3.5.1 凉血通瘀方治疗急性脑出血大鼠脑组织显著差异表达的miRNA

与对照组比较，共有21 个表达有显著差异的miRNA，结果如表1 所示，其中上调表达的miRNA 有9个，下调表达的有12个。

表1 凉血通瘀方治疗脑出血急性期大鼠脑组织显著差异表达的miRNA

3.5.2 显著差异miRNA靶基因预测结果

通过miRanda 软件预测21 个表达有显著差异的miRNA 靶基因，得到1243 个有统计学意义的靶基因，选取靶基因前5名其结果如表2所示。

表2 凉血通瘀方治疗急性脑出血显著差异miRNA的靶基因预测

3.5.3 GO功能分析结果

采用软件Goatools对基因集中的miRNA靶基因进行GO 功能富集分析，将得到的分子功能、生物过程和细胞组分注释结果，按照P值从大到小排列，如图2 所示。图中按富集程度列出排名靠前的30个分类项，分析显示：多数显著差异表达的miRNA 靶基因功能主要参与突触囊泡分泌的调节（regulation of synaptic vesicle exocytosis）、神经递质分泌的调节（regulation of neurotransmitter secretion）和神经递质运输的调节（regulation of neurotransmitter transport）生物过程；主要作为细胞内神经元投射终点（neuron projection terminus）、全膜（whole membrane）、质膜区域（plasma membrane region）和细胞投射（cell projection part）；主要行使小GTPase 绑定（small GTPase binding）、底物特异性跨膜转运蛋白活性（substrate-specific transmembrane transporter activity）和离子跨膜转运体活性（ion transmembrane transporter activity）等分子功能。

图2 miRNA靶基因GO功能分析图

3.5.4 miRNA靶基因KEGG通路富集分析

1243个表达上有显著差异的miRNA靶基因，通过KEGG 通路的富集分析得到显著差异的富集通路结果如图3 所示。这些差异miRNA 的靶基因在癌证通路（Pathways in cancer）、pI3K-Akt 信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、人类乳头瘤病毒感染（Human papillomavirus infection）、神经活性配体-受体相互作用（Neuroactive ligand-receptor interaction）和MAPK 通路（MAPK signaling pathway）等分布广泛。

图3 miRNA靶基因KEGG富集通路图

3.5.5 核心靶基因筛选结果

把1243 个靶基因输入STRING 数据库，靶基因相互作用分数最低为0.900，筛选得到439 个点，359 条线，PPI 富集p-value 为0.0072。运用Cytoscape 软件的cytoHubba 插件从439 个靶基因中用MCC 算法筛选出前10 名的关键靶基因，ADRA2C（rno-miR-133b-3p、rno-miR-204-5p 和rno-miR-204-3p）、CASR（rnomiR-204-3p）、CCL28（16_34601）、CCR1（rno-miR-204-5p）、DRD2（rno-miR-204-3p）、GNAT3（rno-miR-34a-3p）、GRM2（16_34601）、DYNC1LI1（rno-miR-204-3p）、GABBR1（rno-miR-200a-3p、rno-miR-204-3p）、GNAI3（rno-miR-200b-3p），结果展示如下图4。

图4 PPI蛋白网络互作图

4 讨论

miRNA 是生理和病理过程的重要调节器，并影响各种疾病[15-16]。而且，miRNA 网络涉及各种过程，包括中枢和周围神经病变的再生、轴突再生、神经细胞分化和慢性疼痛[17-19]。不断有研究揭示脑出血miRNA表达谱发生改变并在一系列继发损伤中扮演着重要的角色[20]，并广泛参与脑出血后的氧化损伤、炎症等病理生理过程。Iwuchukwu 等[21]通过检测ICH 确诊患者脑脊液中的miRNA 表达谱，发现211 个差异表达miRNA，其中miR-204-5p 高表达与我们的研究结果一致。本研究中，通过实验组和对照组的比较，凉血通瘀方实验组引起21 个miRNAs 的显著表达变化，其中9 个表达下调，12 个表达上调。显著差异表达的21个miRNA 一共预测得到了1243 个靶基因。对靶基因进行GO 和KEGG 富集分析，其中GO 功能分析结果显示，主要参与突触囊泡分泌的调节、主要作为细胞内神经元投射端、主要行使小GTPase绑定等功能。通过KEGG 分析，这些差异miRNA 的靶基因主要参与了癌证通路、pI3K-Akt 信号通路、人类乳头瘤病毒感染和MAPK 通路等信号通路。其中的核心的靶基因为Adra2c、Casr、Ccl28、Ccr1、Drd2、Gnat3、Grm2、Dync1li1、Gabbr1、Gnai3，上述10 个基因对于凉血通瘀方干预急性脑出血有着显著相关性。

脑出血后多巴胺D2 受体（DRD2）表达增加，DRD2 可能在ICH 后具有抗炎作用，DRD2 激动剂具有减轻ICH 后神经炎症和减轻继发性脑损伤的潜力[22]。先前的研究表明DRD2 激动剂具有抗凋亡特性[23]，并且可能参与神经发生和血管生成[24]。另外，DRD2 区域对于收缩压调节具有显著相关性，多巴胺功能系统对于调节血压具有重要作用[25-26]。多巴胺缺失会导致受体依赖性的高血压，并且有报告显示DRD2 基因缺失的小鼠具有活性氧（ROS）依赖性高血压[27]，而大量研究表明高血压是脑出血的主要危险因素[28]。有趣的是，在一篇研究卒中后基因表达内在变化的研究中却发现DRD2基因表达与脑卒中小鼠的行为恢复呈负相关[29]。本研究的前期探索中发现，与模型组相比较，LTP能够改善SHR大鼠神经功能评分。

ADRA2C 是肾上腺素受体-α2（ADRA2）基因的一种亚型，ADRA2 基因家族具有多种血管功能，包括维持基础脑血流、脑血管舒张、血管完整性和血管平滑肌细胞的正常功能[30-33]。其中，ADRA2C的D等位基因可能与血流量或血管功能相关[34]，在血管中发现了高水平的α2-AR 活性，这些受体作为温度受体来介导寒冷诱导的血管收缩，α2-AR 刺激引起血管平滑肌细胞中的钙动员，参与血管的收缩和舒张，影响血压[35]，ADRA2C多态性可能与高血压或脑血流呈正相关。

G 蛋白偶联钙敏感受体CaSR 被认为是多种细胞功能的重要调节剂，在脑缺血急性期，CaSR 在缺血及边缘区表达增加，6 小时再灌注后至三天时间梗死区的星形胶质细胞中表达明显增加，这种表达一直持续到14 天[36]，而在大量浸润的小胶质细胞或（和）巨噬细胞中却难以发现CaRS 的标记。而CaSR 的上调主要影响血管相关细胞如周细胞和内皮细胞，这种现象说明CaRS 可能在脑卒中中发挥着血管重塑和星形胶质细胞增生[36]。并且脑损伤后新血管形成对内源性修复过程具有重要的作用[37-38]，而对血管生成反应的阻断会使脑卒中后的结局恶化[39]。星形胶质细胞有助于血管生成、神经发生、突触形成和轴突重塑，从而促进神经系统的恢复，是脑卒中神经保护和神经修复的治疗靶点[40]。

Grm2 与mGlu 受体具有相关性，Grm2 启动子H3蛋白组乙酰化减少会导致mGlu 受体的减少；而mGlu在卒中中激活会扩大神经元的死亡，这也是脑出血中兴奋性氨基酸如mGlu 带来的兴奋性神经毒性导致的神经损伤[41]。mGlu2 是8 个mGlu 受体亚型之一，在缺血型脑卒中研究中，敲除小鼠mGlu2 基因会显著减少梗死面积，使用mGlu2 受体的阻断药物后发现了神经损伤缓解的现象[42]。我们推测，Grm2 可能通过减少mGlu受体从而抑制mGlu或者其受体导致的脑卒中后神经损伤。

脑缺血可增加CaSR 表达和信号传导，从而下调GABABR1 表达，降低GABA 信号传导响应；降低的GABABR1 表达进一步增加了CaSR 表达和活性，引发了维持神经元过度活跃的前馈反应，这些持续的细胞反应最终导致永久性神经元损伤和细胞死亡，并导致神经变性和学习，记忆，认知或运动障碍[43]。切除Casr基因或通过钙蛋白酶抑制剂阻断Casr 活性在缺血小鼠中提供了强大的神经保护及保留学习和记忆功能，说明CaSR 的过度表达和过度活跃能关键地介导神经元的损伤反应，并且阻断CaSR 的表达或活性可以有效保护神经元免受缺血引起的细胞死亡[43]。

凉血通瘀方中主要的活性成分为槲皮素、山柰酚和大黄素等[44]。其中槲皮素可降低血压，增强毛细血管抵抗力并降低毛细血管脆性。槲皮素的结合自由能（8.8 kcal·mol-1）与布瑞哌唑（brexpiprazole）的结合自由能（9.5 kcal·mol-1）相似，该药物已显示与DRD2[45]结合。有研究[46]报道了槲皮素、山奈酚这些成分主要通过cAMP 信号通路（cAMP signaling pathways）发挥其治疗作用，分子对接验证了DRD2作为槲皮素、山奈酚等活性成分的重要靶点。另外，不同剂量的槲皮素治疗对CCR1 的巨噬细胞表达有差异[47]。大黄素下调CaSR 表达，并通过调节其下游的线粒体和MAPK 信号通路来抑制细胞凋亡[48]。大黄素和大黄酸也可以抑制CCR1 的表达、TNF-α 和IL-6 的产生，p38 MAPK 和NF-κB的激活[49]。说明凉血通瘀方中活性成分对核心靶基因有潜在调控可能。

在以往的研究中，凉血通瘀方干预脑出血的发生与发展机制中鲜有涉及miRNA 的探索，本次筛选出的10个核心miRNA靶基因中多集中在脑缺血中，多与脑缺血发生发展及保护作用相关，脑出血与脑缺血在部分机制上具有相关性。但对于脑出血的作用机理的解释仍不充分。如Grm2 和CaSR 都介导了卒中后神经元凋亡的相关机制，而这些基因对于脑出血的作用都需要进一步的验证才可以确定其相关作用。

5 结论

本次研究通过高通量测序的广筛，找到了10个与凉血通瘀方治疗脑出血的核心基因缩小了LTP 网络药理学靶点范围，为进一步药效机制探索指明方向。关于它们在LTP 干预急性脑出血病理进程及预后的调控机制，或许需要更多的体内体外研究来证实其具体机制。