针刀松解“三合阳”对KOA模型兔膝关节IL-1β、IL-10、TNF-α的影响＊

孙季维，李园源，侯逸敏，魏嘉碧，柴玉卓，张雨晴，王荣国

（北京中医药大学针灸推拿学院 北京 100029）

膝骨关节炎是以关节软骨退行性改变为特征的慢性病[1]，典型临床表现为关节疼痛、肿胀、僵硬及关节活动受限，是中老年人丧失劳动力乃至日常活动能力的重要原因之一。近年来KOA 的患病率越来越高，且呈年轻化趋势[2-3]，以及致病因素和发病机制复杂，目前尚未完全明确，但越来越多的证据表明炎症与KOA 进程密切相关[4]，当前已成为研究热点之一。有研究表明，正常的关节软骨处于降解和修复的动态平衡中，当炎症因子过度表达，则会促进关节软骨的降解，加速KOA 的发展[5]。研究证实[6-7]，IL-1β 和TNF-α在关节炎患者中高浓度存在，是参与软骨退变和降解的重要促炎因子。然而IL-10 作为抗炎细胞因子，能通过抑制软骨细胞凋亡的方式发挥对软骨的保护作用[8]。因此调控炎症因子的表达对于防治KOA 至关重要。

我们在前期临床观察中发现膝后侧牵拉痛和明显压痛是不同程度KOA患者的共同临床体征，并且有研究发现腓肠肌上的“合阳内”“合阳外”“合阳次”（简称“三合阳”）三个结筋病灶点出现频次较高[9]。针刀疗法可通过松解结筋病灶点，直达病所，以松解粘连，调控相关因子的表达，进而调节膝关节内环境，延缓关节软骨退变和破坏来治疗KOA[10]。在既往的实验研究中，针刀的治疗部位主要集中在松解股四头肌、腘绳肌或膝周韧带等结筋病灶点[10-12]，但关于针刀松解腓肠肌上的结筋病灶点治疗KOA 的相关研究鲜有报道。故本研究采用MIA 关节腔注射建立兔KOA 模型，观察针刀松解“三合阳”改善膝关节功能的效果，明确针刀调控膝关节内IL-1β、TNF-α、IL-10 炎症因子的表达和保护关节软骨的作用，初步揭示针刀松解“三合阳”治疗KOA 的相关机制，为完善临床治疗方案提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

采用健康雄性6 月龄新西兰大白兔36 只，体质量2.5±0.5 kg，实验动物由北京富龙腾飞实验动物研究院有限公司提供，实验动物生产许可证号SCXK（京）2018-0009。实验期间分笼独立饲养，温度20-25℃，相对湿度50-70%，可自由获取食物和水。本实验已通过北京中医药大学动物伦理委员会批准（批件号：BUCM-4-20200112003-4070），整个实验过程严格按照实验动物管理规定进行。

1.1.2 主要试剂和仪器

主要试剂：单碘乙酸（货号：I4386，美国Sigma 公司），Zoletil®50（法国Virbac 公司），HE 染色试剂盒（货号：G1120，中国Solarbio公司），IL-1β（货号：16806-1-AP，武汉Proteintech 公司），TNF-α（货号：bsm-33207M，北京Bioss 公司），β-actin 抗体（货号：BS6007M，南京Bioworld 公司），兔IL-10 酶联免疫吸附测定试剂盒（货号：ml041623，上海酶联免疫公司），反转录试剂盒（货号：K1622，美国Thermo Scientific公司）

主要仪器：一次性小针刀（江苏华友医疗器械有限公司）、医用诊断X 射线管组件（型号：E7239X，生产序列号：19J1036，佳能电子管器件株式会社），石蜡包埋机、石蜡切片机（型号分别为：EG1150，RM2245德国Leica 公司），BX43F 光学显微镜（型号：BX43，日本Olympus 公司），电热鼓风干燥箱（型号：101-1A，天津市泰斯特仪器有限公司），高速台式离心机（型号：5430R，德国Eppendorf 公司），多功能酶标仪（型号：M2e 美国Molecular Devices 公司），CFX ConnectTM荧光定量PCR 仪、ChemiDocTMMP 化学发光成像系统（型号分别为：1855201，12003154，美国Biorad公司）

1.2 方法

1.2.1 分组

将36只新西兰兔采用随机数字表法分为空白组、模型组、针刀组，每组12 只。分别于造模第4 周、第6周后每组随机挑选6只取材。

1.2.2 模型制备及评价

造模前一天，随机挑选24只实验兔右膝关节周围剃毛备用。具体造模方法如下：俯卧位固定实验兔，采用Zoletil®50 1 mL 在兔左臀大肌注射麻醉后取仰卧位，于右膝关节周围碘伏消毒，将MIA以2.5 mg·kg-1向关节腔内推注，以建立兔KOA模型。各组实验兔每日笼外驱赶活动30 min。模型鉴定：造模2 周后，行膝关节Lequesne MG 评分[13]，其总分≥4 分表示造模成功，并对针刀组进行相应干预。

1.2.3 干预方法

造模成功后，针刀组依据《中国经筋学》[14]和《动物解剖学》[15]，选取筋结点“合阳次”（足太阳经筋：小腿后侧，腘窝下缘中点下，平腓骨小头下缘水平处；位于腓肠肌肌腹联合处），“合阳内”（足太阳经筋：小腿后侧，合阳次内上方，腘窝下缘处；位于腓肠肌内侧头），“合阳外”（足太阳经筋：小腿后侧，腘窝下缘，腓骨小头内侧；位于腓肠肌外侧头），在施术部位用碘伏消毒三遍，然后铺无菌洞巾，使治疗点正对洞巾中央，术者戴无菌手套，采用一次性0.4×40 mm 无菌小针刀进行松解。刀口线平行小腿长轴，垂直进针，分别抵达病变处纵向疏通3 次，操作结束后用无菌干棉球在手术部位按压1 min，每3 天干预1 次。空白组和模型组只做相同的抓取和固定，不予针刀治疗。

1.2.4 标本采集及制备

（1） 采集关节液

取材前备皮，碘伏消毒，取Zoletil®50 1 mL 肌肉注射麻醉，兔右膝关节保持半屈曲位，用5 mL 注射器抽取2 mL生理盐水于外膝眼处缓慢注入，反复活动膝关节，然后回抽关节液至EP 管中，做好标记，于冰冻离心机4℃，3000 rpm·min-1，离心15 min，用移液枪吸取上清液置于-80 ℃冰箱中保存。

（2） 采集膝关节股骨内外侧髁

打开关节囊，暴露关节腔，用眼科剪离断周围韧带及前后交叉韧带，清理半月板，分离膝关节，取股骨下段1/3，清理周围脂肪、韧带和肌肉等组织，用生理盐水冲洗干净后，用咬骨钳分离股骨内侧髁软骨，放入冻存管中，做好标记，-80℃冰箱中保存。股骨外侧髁投入4%的多聚甲醛溶液中固定72 h 后，转移至10%EDTA脱钙液中。

1.2.5 主要指标检测及方法

（1） 行为学观察

采用Lequesne MG 量表，分别在造模第4 周、第6周后观察各组实验兔行为学变化。从局部疼痛刺激反应、步态改变、关节活动范围、关节肿胀度四个方面去评估兔右膝关节功能，总分11 分，分值越高提示膝骨关节炎病变程度越重，关节活动能力越差。要求由2 位对分组情况不知情人员分别进行评分并记录分值，结果取二者平均值，每次评分均由相同人员进行。

（2） 影像学观察

对各组实验兔行右膝关节正位X 线摄片。X 线检测方法：取仰卧位，保持髌骨位于正前方，放射球管距离膝关节120 mm，检测参数设置为照射电压50 kV、照射电流200 mA、照射量1000 mAs、照射时间5 ms。采用K-L 分级标准[16]对各组实验兔右膝关节骨质增生、胫股关节间隙狭窄程度进行分级。

（3） 大体形态观察

观察所采集关节液色泽，并且在完全暴露膝关节后，肉眼观察膝关节软骨、滑膜大体情况，包括颜色、形态等情况。

（4） 病理形态学观察

将脱钙完全的股骨外侧髁修切为适宜大小后经过脱水、透明、浸蜡后进行石蜡包埋，制备6 μm厚的石蜡切片以行HE 染色，光镜下观察软骨形态改变并进行Mankin’s评分，评分越高说明软骨破坏越严重[17]。

（5） ELISA检测关节液中IL-10水平

从4℃冰箱中取出试剂盒室温平衡1 h，并从-80℃冰箱中取出待测样品冰上解冻，设置标准品孔和样品孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL。于待测样品空中先加40 μL 样品稀释液，再加10 μL 待测样品，轻轻晃动均匀，除标准品孔外每孔加入酶标试剂100 μL，封板膜封板后置37℃恒温箱中温育60 min。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后其去，重复5次，拍干。每孔先后加入显色剂A、B 液各50 μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 min后每孔加终止液50 μL，在15 min内使用多功能酶标仪以450 nm波长检测样品中的IL-10的含量。

（6）WB检测关节软骨中IL-1β和TNF-α的蛋白表达水平

从-80℃冰箱取出软骨组织，用液氮将软骨组织磨碎，加入RIPA 裂解液充分匀浆，冰上裂解30 min后，置于冰冻离心机4℃，12000 rpm，离心15 min，收集上清液，BCA 定量法测定上清液蛋白浓度，加入Loding Buffer 后95℃加热5 min 变性。制备浓缩胶和分离胶，取6 μg 上样，经电泳、电转至PVDF 膜后，用8%的脱脂奶粉封闭2 h，TBST 洗3 遍，每遍10 min，将膜分别浸泡于IL-1β、TNF-α 抗体（1:2000）孵育液中，4℃孵育过夜，加入二抗（1:8000），室温摇床孵育1 h，ECL 法显色照相并用Image J 软件分析IL-1β、TNF-α的蛋白和内参蛋白的灰度值，分别以IL-1β、TNF-α和内参蛋白灰度值比值作为目标蛋白的相对表达量。

（7）RT-PCR 检 测 关 节 软 骨 中IL-1β 和TNF-α 的mRNA表达水平

从-80℃冰箱中取软骨组织，置于研钵中加入液氮快速研磨，随后装入预冷的EP 管中，以Trizol 试剂提取软骨组织的总RNA，用核酸紫外分光光度计测定RNA 纯度和浓度；根据浓度取1 μg 总RNA 反转录成cDNA后置于-20℃保存备用。采用10 μL PCR 反应体系：取cDNA 1 μL，上下游引物各0.4 μL，无酶水3.2 μL 及Power SYBRTMGreen PCR 预混液5 μL；PCR 反应程序：预变性95℃5 min，变性95℃30 s，退火60℃30 s，延伸72℃1 min 15 s，45 个循环。以GAPDH 为内参基因，计算各目的基因2-△△Ct比较分析mRNA 表达水平。引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.6 统计学处理

采用SPSS20.0 软件进行统计学分析。符合正态分布和方差齐性的数据方可以使用均数±标准差（±s）表示，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。采用Graph pad Prism 9.0软件绘制各种统计图。

2 结果

2.1 各组Lequense MG 评分结果

分别在造模第4 周、第6 周后，模型组Lequense MG 行为学评分较空白组显著升高（P ＜0.01），针刀组较模型组显著降低（P ＜0.01）（图1）。

图1 Lequesne MG 评分结果

2.2 X线观察结果

造模第4周后，空白组关节间隙对称，边缘未见明显骨赘增生；模型组关节间隙变窄，有骨赘形成，K-L评分显著高于空白组（P ＜0.01）；针刀组关节间隙稍有变窄但未见明显骨赘，K-L 评分显著低于模型组（P ＜0.01）。造模第6 周后，空白组关节间隙可疑狭窄，边缘未见明显骨赘增生；模型组关节间隙明显变窄，甚至消失，有明显骨赘形成，骨端明显硬化，少数伴有畸形，K-L 评分显著高于空白组（P ＜0.01）；针刀组关节间隙虽有变窄但未见消失情况，少量骨赘形成，骨端轻度硬化，K-L 评分显著低于模型组（P ＜0.01）（图2-图3）。

图2 膝关节K-L 评分结果

2.3 大体观察结果

造模第4 周后，空白组软骨表面光滑，呈淡蓝色，边缘无骨赘，关节液透明澄清，滑膜未见肥厚；模型组较空白组软骨表面粗糙有裂纹，颜色变黄，暗淡无光泽，边缘有疑似骨赘，滑液呈淡黄色，滑膜增厚；针刀组较模型组软骨表面欠光滑，裂纹较模型组少，边缘欠光滑，关节液呈淡黄色半透明状，滑膜稍增厚。造模第6 周后，空白组软骨表面光滑，但色泽稍暗，边缘规整，关节液呈透明状，滑膜未见肥厚；模型组较空白组软骨部分缺失，暴露黄色软骨下骨，边缘明显骨赘增生，膝关节增大，关节液呈浑浊状淡黄色，滑膜明显增厚；针刀组较模型组软骨表面仅有裂纹，边缘有骨赘，关节液呈淡黄色，滑膜增厚（图3）。

2.4 关节软骨HE 染色及Mankin’s 评分结果

造模第4 周后，空白组软骨表面规则，4 层结构清晰可辨，基质染色正常；模型组较空白组软骨结构不规则，有血管翳形成，软骨细胞簇集或明显减少，基质着色减少，潮线模糊或缺失，Mankin’s 评分显著高于空白组（P ＜0.01）；针刀组较模型组软骨细胞增加，基质着色增加，Mankin’s 评分显著低于模型组（P ＜0.01）。造模第6 周后，空白组软骨表面规则，结构清晰可辨，基质染色正常；模型组较空白组软骨结构分辨不清，软骨层部分剥脱至辐射层或全部剥脱，软骨细胞排列紊乱，弥漫性增加，簇集现象严重，基质着色减少，潮线消失，Mankin’s 评分显著高于空白组（P ＜0.01）；针刀组较模型组软骨结构趋于规则，软骨层剥脱减少，Mankin’s 评分显著低于模型组（P ＜0.01）（图3-图4）。

图3 各组兔膝关节X线正位、股骨髁大体、关节软骨病理染色比较（HE，×100μm）

图4 关节软骨Mankin’s评分结果

2.5 关节液中IL-10蛋白表达结果

造模第4 周、第6 周后，模型组较空白组关节液中IL-10 表达水平显著降低（P ＜0.01）；针刀组较模型组显著升高，其中造模第4 周后（P ＜0.01），造模第6 周后（P ＜0.05）（图5）。

图5 关节液中IL-10表达结果

2.6 关节软骨中IL-1β和TNF-α蛋白表达结果

造模第4 周、第6 周后，模型组较空白组IL-1β 和TNF-α 蛋白表达水平显著升高（P ＜0.01），针刀组较模型组显著降低（P ＜0.01）（图6-图7）。

图6 关节软骨中IL-1β和TNF-α的蛋白表达Western Blot图

图7 关节软骨中IL-1β和TNF-α蛋白表达结果

2.7 关节软骨中IL-1β和TNF-α mRNA 表达结果

造模第4 周、第6 周后，模型组较空白组IL-1β 和TNF-α mRNA 表达水平显著升高（P ＜0.01）；针刀组较模型组IL-1β 和TNF-α mRNA 表达水平显著降低（P＜0.01）。（图8）。

图8 关节软骨中IL-1β和TNF-α mRNA 表达结果

3 讨论

中医称KOA 为“膝痹”，是一种筋骨共病、痿痹共存的临床常见疾病，属于“筋痹”范畴[18]。韩清民等[19]认为KOA 的病机演变规律为：筋伤是起因，筋病损骨是病变过程，筋骨同病是最终结果。当“筋伤”时周围的筋结点因经脉气血津液运行不畅而失去濡养，经久形成粘连、条索、结节等，即结筋病灶点[20]。本研究采用的治疗部位“三合阳”是足太阳经筋在膝关节周围的常见病灶点[19]。“阳气者，精则养神，柔则养筋”，“合阳”为膀胱经上行阳热之气聚集之义。因此针刀松解“三合阳”的刺激量大，可以快速激发足太阳经筋膝周的阳气，温通局部气血，进而濡养经筋，达到柔筋缓节的目的。

腓肠肌是人体步行中的一组重要肌肉群，“三合阳”分别位于腓肠肌内侧头、外侧头和肌腹联合处。有研究认为太极拳运动中腓肠肌被优先激活，其作用可能不是补偿，而是先导[21]。Morrison[22]指出在一个完整步态中，膝关节反作用力最大的时候，腓肠肌的肌力也达到最大，并且腓肠肌收缩时间的占比较大。以上说明膝关节受力变化与腓肠肌状态的改变密切相关。王建等[23]通过针刀松解腓肠肌内侧头止点治疗KOA 后对恢复伸膝功能取得较好疗效。王维军[24]采用手术治疗重度膝关节屈曲挛缩畸形后，行后关节囊的广泛松解，同时对腓肠肌及周围挛缩组织进行适度松解，以期恢复合理的软组织平衡。因此本研究采用针刀松解“三合阳”，可以直接松解腓肠肌并缓解其痉挛或劳损状态使其柔软，激活腓肠肌的生物力学特性，进而改善膝关节力学平衡，保护关节软骨。结合针刀治疗明显减轻了KOA 模型兔的关节肿胀、疼痛程度，增加关节活动范围，所以评估膝关节功能的Lequense MG 评分才降低。本研究证实针刀松解“三合阳”改善膝关节功能与减少软骨退变和保留关节间隙密切相关。利用X 线结果进行K-L 评分是KOA 分级诊断的重要依据[25]，其中关节间隙越小提示软骨存留越少。本研究结果显示KOA 模型兔的胫股关节间隙随时间推移逐渐变窄，甚至消失，而接受针刀干预的兔胫股关节间隙始终保留。上述影像学的变化与病理学染色结果也是吻合的。关节软骨HE 染色发现针刀干预后的股骨髁上软骨结构趋于规则，软骨层少量剥脱，软骨面轻微磨损，证实针刀松解“三合阳”可以减少软骨退变，有保护关节软骨的作用。此外，软骨细胞簇集现象较轻、基质着色保留较好的现象也提示针刀松解“三合阳”与减轻膝关节炎症反应有重要关系。IL-1β 和TNF-α 是OA 进程中促进软骨基质降解和关节软骨破坏的两种最为关键的促炎细胞因子[26-27]。IL-1β 和TNF-α 上调促进软骨破坏相关的因子生成（如金属蛋白酶、诱导酶、自由基等），同时抑制软骨特异性基因表达（如Ⅱ型胶原蛋白、连接蛋白、蛋白聚糖等）[28]。本研究结果显示模型组较空白组IL-1β 和TNF-α 的蛋白和mRNA 表达水平增高，且随着时间的推移第6 周较第4 周更加严重。针刀组较模型组表达水平降低，说明针刀松解“三合阳”可以通过抑制IL-1β 和TNF-α 的表达，减轻炎症反应，减少对关节软骨细胞和软骨基质的破坏，达到保护关节软骨的效果。

退行性关节炎在发病的早期往往因为软骨磨损、骨质增生而刺激诱发滑膜炎症反应，引起滑膜增厚、水肿、积液等变化[29]。滑膜炎又会通过其所产生的炎症递质直接作用于关节软骨而导致结构改变[30]。IL-10是一种具有抗炎特性的细胞因子，能促进关节软骨Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的合成，抑制IL-1β和TNF-α的分泌，阻止软骨细胞凋亡，从而保护关节软骨[8,31-32]。本研究结果显示在造模第4 周、第6 周后，针刀组较模型组关节液颜色稍淡，滑膜稍薄以及关节液中IL-10表达水平显著增加。因此针刀松解“三合阳”也能通过增加抗炎因子IL-10 的分泌来改善关节内环境，减轻炎症反应，发挥软骨保护效应。

综上所述，针刀松解“三合阳”能保护关节软骨，改善膝关节功能。其作用机制可能是一方面能激发膝周的阳气，温通气血以濡养筋脉，进而发挥“柔筋缓节”的作用。另一方面针刀能通过松解腓肠肌，纠正膝关节力学失衡，减少关节软骨中IL-1β 和TNF-α 的表达减轻炎症反应，增加关节液中IL-10 的分泌抑制相应炎症因子释放，共同保护关节软骨，减少软骨破坏，保留胫股关节间隙从而改善关节功能。本研究也为临床从足太阳经筋治疗KOA 提供了实验依据。KOA 的进展与滑膜炎症密切相关，但本实验尚未研究针刀松解“三合阳”调控滑膜组织炎症相关因子的表达规律，后续将深入研究。