黄连NRAMP5基因的克隆与生物信息学分析＊

王文斌，朱海兰，莫 静，刘 迪，胡志刚＊＊，汪 波

（1. 湖北中医药大学药学院 武汉 430065；2. 湖北省药品监督检验研究院 武汉 430075；3. 湖北大学生命科学学院 武汉 430062）

1 引言

从广义上说，重金属是指金属密度大于5g/cm3的金属[1]。按照这个定义，有53 种天然存在的金属属于重金属。重金属在高浓度下对植物均有毒害，但其中一些，例如锌（Zn）、铁（Fe）和铜（Cu）等，在低浓度时是必要的营养素，而其他一些，例如镉（Cd）、铬（Cr）和铅（Pb），即使在极低的浓度下也会对植物造成危害。那些在低浓度下对植物表现出毒性的重金属通常被称为重金属[2]。镉被认为是对人体健康最危险的重金属元素之一。人体摄入镉过量会导致以肾小管病变为主的肾脏损害、以肺炎和肺水肿等为代表的呼吸系统损伤，造成骨骼疏松、萎缩、甚至断裂等，严重危害人类健康。镉不是植物生长的必需元素[3]，对植物也有很强的毒害作用，镉大量积累会影响植物的生长发育，导致植物叶片黄化枯败、株高降低等现象，甚至使植物死亡[4-5]。植物在进化过程中，已经发展出了独特的方法来获取必需的营养元素，抑制或富集土壤中的有毒金属元素[6]。对重金属在植物中累积途径的深入了解将对植物生长发育研究和人类健康具有重要意义，而金属转运蛋白的克隆则是关键的第一步。

在植物吸收金属后，金属离子与载体蛋白结合形成螯合物进入到细胞内[7-8]。植物重金属转运蛋白包括锌铁转运蛋白、重金属ATP 酶、自然抗性相关巨噬细胞蛋白等，其中大量研究表明自然抗性相关巨噬细胞蛋白可以特异性转运镉和锰[9]。NRAMP 家族蛋白是一类高度保守膜蛋白，在细菌、真菌、植物和动物体内都广泛存在。NRAMP 蛋白在不同物种间表现出功能差异和特异性表达。MmNRAMP1 最早在小鼠身上被发现，它主要通过对金属离子吸收而调节对分枝杆菌的吞噬作用[10]。而植物中普遍存在多个NRAMP家族基因，模式植物拟南芥的NRAMP家族成员有6 个，水稻中有7 个，烟草有9 个。Bozzi 等[11]发现，NRAMP能够结合或运输生物所需的二价金属（Mn2+，Fe2+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Zn2+）和有毒金属（Cd2+，Pb2+，和Hg2+），但不能运输二价碱土金属离子（Mg2+和Ca2+）。超积累型东南景天有6个NRAMP家族基因，具有重金属离子吸收和转运功能[12-13]。如苹果MhNRAMP1基因能够在根部转运镉离子，并抑制了抗细胞死亡相关基因的表达[14-15]。大豆GmNRAMP1可能参与镉离子吸收转运[16]。莱茵衣藻NRAMP3的表达可能具有减少莱茵衣藻细胞内Cd 的积累的作用[17]。超积累型东南景天受到镉胁迫时，SaNRAMP6基因叶片表达量下降，根系表达量显著增加，表明SaNRAMP6可能直接参与镉的吸收 和 转 运 过 程[18]。 Cailliatte 等[12]认 为 拟 南 芥AtNRAMP6是一种细胞内金属转运体，主要作用于液泡内膜，并能影响镉在细胞中的分布和可利用性。辣椒NRAMP1和NRAMP3基因主要参与Cd 从根部转运到地上部的过程，NRAMP2、NRAMP5、NRAMP6基因参与辣椒根对Cd的吸收过程[19]。

黄连为湖北省“一县一品”的道地药材，湖北省利川市及周边地区是黄连的道地产区，在我国传统中医药中具有悠久的使用历史，最早可追溯到我国已知现存最早的本草著作《神农本草经》。黄连作为我国著名的传统中药，不仅在临床上大量使用，还出口到国外，使其需求量大大增加。但是，黄连对生长环境要求严格，生长期长，导致黄连市场供需矛盾加剧，野生黄连被过度采挖逐渐变成三级濒危植物，现市场上使用的主要是人工种植黄连。目前栽培黄连主产地为重庆石柱县、湖北利川市，以及四川、湖南等地也有种植。而近年来黄连药材出口检测中发现部分重金属超标，特别是镉超标，严重影响黄连产业发展[20]。对拟南芥、水稻等模式植物的研究结果表明，NRAMP 蛋白家族在植物对镉的吸收和转运中起着重要作用。

2 研究思路与方法

本文旨在克隆分析黄连NRAMP基因特性，探讨黄连Cd 吸收转运分子机制。以黄连基因组[21]测序结果为基础，通过比对筛选出与拟南芥NRAMP基因同源性较高的黄连NRAMP5基因，通过PCR 技术克隆该基因的开放读码框，并通过生物信息学分析黄连NRAMP5蛋白的理化性质、亚细胞定位、跨膜结构域、系统进化关系等（图1），对基因功能以及编码蛋白的性质作出初步的判断和预测，为研究黄连体内重金属镉转运机制以及基因的功能作用提供参考依据，以期为后续的CcNRAMP5基因表达分析和功能验证研究提供基础。

图1 技术路线图

3 研究与分析

3.1 材料、试剂与仪器

3.1.1 材料

黄连植株采自湖北省神农架林区，种植于湖北省药品监督检验研究院分子生物实验室，经DNA条形码鉴定为毛茛科植物味连（Coptis chinensis）。实验材料系实验室水培培养3周长势良好的黄连叶片。

3.1.2 试剂

pEASY®-Blunt 克隆载体和Trans1-T1 大肠杆菌感受态细胞购自北京全式金生物科技有限公司。HLingene 琼脂糖凝胶回收/PCR 产物纯化试剂盒和Thermo Fisher cDNA Synthesis Kit 反转录试剂盒购于上海惠凌生物技术有限公司。IPTG 溶液（50 mg·mL-1）、X-Gal 溶液（20 mg·mL-1）、Amp 溶液（100 mg·mL-1）购自索莱宝生物科技有限公司。高效率PCR 酶KOD Dash 购于东洋纺（上海）生物科技有限公司。植物总RNA 提取试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司。引物合成及测序由武汉天一华煜基因科技有限公司完成。

3.1.3 仪器

冷冻高速离心机（Thermo Fisher Scientific）；Nano drop-2000 超微量分光光度计（Thermo Fisher Scientific）；T100 型PCR 扩增仪（美 国Bio-Rad）；GGI54TW 蒸汽消毒锅（美国ZEALWAY 公司）；BCD-225TMPM 冰箱（海尔）；MX-RL-E 旋转混悬仪（北京大龙兴创）；DYY-10C 电泳仪（北京六一）；Gel Doc XR+凝胶成像系统（美国Bio-Rad 公司）；LWB-26 双列六孔电热恒温水浴锅（上海龙跃）；UF55 干燥箱（德国Memmert 美墨尔特）；2.5μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL 移液器（eppendorf，德国艾本德股份公司）等分子生物实验室常规仪器等。

3.2 方法

3.2.1 目的基因的获得

以拟南芥、水稻、东南景天等有文献报道的NRAMP 蛋白序列为参考序列，比对黄连基因组，通过blastp比对寻找黄连NRAMP家族基因（e值≤e-10），并且将它们在Pfam 蛋白质家族数据库（http://pfam.xfam.org/search）中进行检验以确保其包含NRAMP 保守结构域（PF01566），得到黄连NRAMP5基因。

3.2.2 总RNA的提取、检测及cDNA的合成

黄连叶片用清水冲洗洗净，滤纸吸干，并用液氮研磨成粉末，使用天根植物总RNA提取试剂盒提取总RNA。使用琼脂糖凝胶电泳和超微量分光光度计检测提取的RNA 质量和浓度。然后以提取的总RNA 为模板，采用试剂盒反转录合成cDNA，50℃水浴20 min，85℃水浴10 min，灭活逆转录酶，储存在-20℃。

3.2.3 黄连NRAMP5基因的克隆

依据已测得的黄连基因组数据，查找该基因上下游2000 bp 长度，分别设计扩增引物（上游引物LF:AAGGAGGAGTGCATCCATTG，LR: CTGCATCTTTGG GTGTCAT；下游引物RF: ATGCAGTGATCTTACTCTC AATTCGGC, RR: TGTGGCAATGTGTGATTGTG）将目的序列片段扩增，以确定黄连NRAMP5基因编码序列。根据获得的黄连NRAMP5基因序列，设计特异性扩增引物NRAMP-5F：5’-ATGGAAAGTGAAAATAC CCAAAAGG-3’，NRAMP-5R：5’-CTATTTATTCTGA TGTGTCATTTCAGC-3’。以反转录得到的黄连叶片cDNA 为模板进行PCR 扩增，获得NRAMP5的完整编码序列。PCR 反应体系为：1μL KOD Dash，5μL 10 ×Buffer for KOD Dash，5μL 2 mM dNTPs，3μL cDNA，34μL ddH2O，1μL Forward Primer（10μmol·L-1），1μL Reverse Primer（10μmol·L-1），共50μL。PCR 反应程序为：95℃5 min；95℃30 s，62℃30 s，74℃1 min 30 s，反应进行32个循环；74℃10 min。

PCR 产物经切胶回收后，纯化产物与pEASYBlunt 克隆载体连接并转化至Trans1-T1 感受态细胞，随机挑选阳性克隆经菌液PCR 验证长度无误后送武汉天一华煜基因科技有限公司测序。

3.2.4 黄连NRAMP5基因的生物信息学分析

序列组装完成后，利用TBtools 软件[22]查找黄连NRAMP5基因的开放阅读框并翻译成氨基酸序列，在NCBI 数据库中对氨基酸序列进行Blastp 比对；利用ExPASy 在线软件分析NRAMP5编码氨基酸序列的组成和理化性质；利用ProtScale 在线工具进行蛋白疏水性分析；利用SignalP 进行蛋白信号肽预测；利用ProtComp 在线软件对NRAMP5的氨基酸序列进行亚细胞定位；利用TMHMM 通过隐马尔可夫模型来预测蛋白跨膜区域判断其是否为跨膜蛋白；利用SPOMA分析NRAMP5的蛋白质二级结构并进行预测，以了解局部空间结构；利用SWISS-MODEL 预测CcNRAMP5蛋白的三级结构；使用MEGA 6.05 软件对氨基酸序列进行多重比对，采用Neighbor-Joining 法构建蛋白质系统发育树，Bootstrap 统计检验次数为500，其他参数设置为默认参数。

3.3 结果

3.3.1 黄连RNA的提取和黄连NRAMP5基因的克隆

根据试剂盒说明书，从黄连叶片中提取总RNA，选取凝胶电泳条带清晰、吸光度与浓度均满足实验要求的RNA 作为模板RNA。用反转录试剂盒将RNA 样品合成cDNA第一条链。

以黄连叶片cDNA 为模板，针对NRAMP5基因设计的引物扩增了约1500 bp 的PCR 产物，与预期大小一致。将该片段切胶回收后与pEASY- Blunt 载体连接，转化至大肠杆菌感受态细胞，PCR 鉴定为阳性克隆的菌液进行测序，最后将序列提交至GenBank，基因登录号为KAF9609000.1。

用CodonCode Aligner 软件拼接测序结果的峰图，得到1611 bp 的cDNA 序列，经TBtools 软件分析发现其为一个完整的开放阅读框，共编码536 个氨基酸。通过NCBI blastp 将该氨基酸序列与NR 数据库进行比对，结果表明，与GenBank 已报道的其他植物的NRAMP5基因具有较高的相似性，将该基因命名为CcNRAMP5。利用Pfam 分析氨基酸序列的保守结构域，发现CcNRAMP5 蛋白的第63-425 位氨基酸残基是典型的NRAMP结构域（PF01566），同时在第279-282 氨基酸残基处有一个N-糖基化位点（Nglycosylation site），属于NRAMP超家族。

3.3.2CcNRAMP5基因编码蛋白的序列分析

（1） 理化特性分析

利用ExPASy 数据库的ProtParam 工具分析CcNRAMP5基因转化的蛋白序列，发现该蛋白质的分子量为58.19 kD，等电点为7.62，带负电荷的残基（Asp+Glu）为37，带正电荷的残基（Arg+Lys）为38，含有20种氨基酸，亮氨酸含量最高，占比14%，色氨酸含量最低，占比1.3%，分子式为C2683H4257N667O729S21。蛋白质不稳定系数为33.7，属于稳定蛋白质。

使用EXPASY 的Protscale 在线工具预测NRAMP5蛋白的亲水性和疏水性（图2），发现在第35 个氨基酸位置，最低峰值是-3.022，在第184 个氨基酸位置，最高峰值是3.711，平均亲水性为0.574，这表明该蛋白是疏水性蛋白。

图2 CcNRAMP5蛋白的亲疏水性预测结果

（2） CcNRAMP5 蛋白信号肽、亚细胞定位、跨膜结构域预测

SignalP-5.0 Server软件分析结果显示，含有Sec信号肽（Sec/SPI）的可能性为0.0016，不含有信号肽（Other）的可能性为0.9984，预测CcNRAMP5蛋白不含信号肽序列，不属于分泌型蛋白。使用ProtComp 9.0 对CcNRAMP5的亚细胞定位进行预测，预测结果表明CcNRAMP5 蛋白质定位于质膜。利用TMHMM Server v. 2.0 预测CcNRAMP5 蛋白的跨膜结构域（transmembrane domain，TMD），对应的氨基酸残基区域分别为78-110、121-143、147-169、178-200、220-242、263-285、323-345、365-387、391-413、426-448、463-485。结果表明，CcNRAMP5 蛋白含有11 个跨膜区域，具有膜蛋白的重要特征（图3）。

图3 黄连NRAMP5蛋白跨膜结构域分析

（3） CcNRAMP5蛋白二级结构预测

经PRABI 网站的SOPMA 程序对CcNRAMP5 蛋白二级结构进行分析，预测发现CcNRAMP5 蛋白主要由α 螺旋（a helix）、延伸链（Extended strand）、β 转角（Beta turn）和无规则卷曲（Random coi）四部分结构组成，分别占比47.57%、13.99%、2.99%和35.45%。α-螺旋与无规则卷曲是多肽链的主要结构元件。

（4） 三维建模

三级结构预测分析显示（图4），CcNRAMP5 蛋白与葡萄球菌锰转运突变体MntH 的晶体结构（二价金属阳离子转运体MntH）具有37%的序列相似性，以该蛋白（SMTL ID：5m8k.1.A）为模板，通过同源建模构建CcNRAMP5 蛋白的三级结构，用于建模的氨基酸残基范围为36-493位，占编码氨基酸总数的85.26%。

图4 黄连NRAMP5蛋白的三级结构

3.3.3 多序列比对分析

为研究黄连CcNRAMP5 蛋白在物种中的进化位置和亲缘关系，利用MEGA 6.05对水稻（Oryza sativa）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、欧洲油菜（Brassica napus）、波兰小麦（Triticum polonicum）、可可（Theobroma cacao）、大麦（Hordeum vulgare）等植物的NRAMP5蛋白序列进行进化树分析比较（图5）。结果表明，黄连CcNRAMP5与同为毛茛目的博落回McNRAMP5（Macleaya cordata, accession no.OVA12788.）、罂 粟PsNRAMP5（Papaver somniferum,accession no. XP_026445592.）亲缘关系最近，与桑（Morus alba）、苹果（Malus domestica）、可可（Theobromacacao）、香橙（Citrus junos）、甜橙（Citrus sinensis）等聚为一个大类。水稻与大麦、小麦聚为一支，可能与其均为单子叶植物相关。

图5 黄连NRAMP5蛋白的多序列比对分析

4 讨论

黄连属于毛茛科植物，是现存双子叶植物的重要基部类群之一，其根茎作为中药使用已有2000多年的历史，不但是中医处方最常用品种，也是中成药的重要原料。据《全国中成药品种目录》统计，以黄连作原料制生产的中成药有黄连上清片、香连丸等108 种之多[23]。黄文丽等人[24]利用ICP-MS、细胞分馏、连续萃取等方法分析镉在黄连中的分布及化学形态，发现黄连中Cd 的累积分布为：根＞茎＞叶＞子实，大部分富集在根部，少量迁移到地上部，且Cd主要积累在周皮、皮层、髓和根际维管束中，外周皮和皮层中Cd含量较高，髓和根际维管束中Cd含量较低，同时还发现在黄连中Ca 与Cd 的时空分布位置相似，认为Ca2+通道是Cd 进入植物的一条途径，对二价阳离子转运蛋白的挖掘研究对解析其重金属镉富集机制，对推动其无公害种植具有重要的现实意义。

NRAMP 家族基因在进化过程中高度保守，广泛分布于哺乳动物、酵母和高等植物中，并参与了金属转运和抗微生物感染等多种过程。到目前为止，该家族的几个成员已经从拟南芥、水稻和番茄中分离出来。在本研究中，从黄连中克隆获得可能参与镉吸收转运的NRAMP基因CcNRAMP5，并以此为基础对其基本理化性质、亚细胞定位以及结构组成等方面进行了分析。CcNRAMP5 蛋白具有11 个跨膜区，在第279-282 位氨基酸残基处存在一个N-糖基化位点，含有一个NRAMP 特征结构域，亚细胞定位在质膜上，这符合NRAMP 蛋白的重要特征。序列相似性比对和系统进化树分析表明，黄连CcNRAMP5 蛋白与博落回、罂粟等植物的NRAMP5 蛋白亲缘关系最近，序列相似性高，同时推测CcNRAMP5 蛋白可能与这些蛋白具有相似功能。

在水稻中，OsNRAMP5表达于质膜中，参与水稻锰、铁、镉的转运，在水稻根表皮、外皮层、皮层外层以及木质部周围组织中均有表达[25-27]。大麦HvNramp5定位在质膜上，是镉和锰的金属转运体[28]。拟南芥AtNRAMP3和AtNRAMP5位于液泡膜上，在拟南芥的根和叶中均有表达，作为镉转运蛋白，他们参与镉离子向细胞质的外排，起重金属解毒作用[29]。波兰小麦TpNRAMP5可以运输Cd、Co、Mn，但对铁和锌含量没有影响[30]。烟草中NRAMP基因在生物胁迫响应和次生代谢途径中具有特异性。可可中TcNRAMP3和TcNRAMP5可以转运生长必需的二价金属阳离子（Fe、Mn）和Cd2+，敲除TcNRAMP5有望获得低Cd 品种可可[31]。这说明NRAMP家族基因在维持植物体对金属的吸收和运输中起重要作用，尤其是对二价金属离子，如Fe、Mn、Zn、Cu 和Cd。CcNRAMP5 是第一个从黄连植物中分离出来的NRAMP 金属转运蛋白家族成员，与桑（Morus alba）[32]、苹果（Malus domestica）[15]、可可（Theobroma cacao）、香橙（Citrus junos）[33]亲缘关系较近，可能与黄连植物体内包括Cd在内的二价金属离子的吸收和转运有关，其机制和功能在进一步的功能验证工作中将进行探讨。

5 结论

综上所述，本次研究首次通过TA 克隆得到黄连NRAMP5基因，并运用生物信息学方法对其理化性质、结构特征等进行了分析预测，综合前人研究结果，笔者推测黄连NRAMP5基因可能在黄连Cd 的吸收转运过程发挥重要作用。