芪参益气滴丸对AopE基因敲除小鼠动脉粥样硬化中Th17细胞的作用及其网络药理学靶点分析＊

张博承，彭 立，＊＊，许 滔，郭磊磊，，谢 静，周玉萍，骆胤尧，肖琼艳，杨双双，巫廷春，殷念念

（1. 贵州中医药大学第二临床医学院 贵阳 550002；2. 贵州中医药大学第二附属医院 贵阳 550001）

冠状动脉粥样硬化性心脏病（简称冠心病）是由于冠状动脉狭窄或堵塞，导致供血心肌缺血缺氧甚至坏死的严重缺血性心血管疾病，在病理上是一种以胆固醇沉积和慢性炎症反应为特点的心血管疾病[1]。冠心病是危害人类健康的重大疾病之一。根据2018 年中国心血管病报告，我国心血管病患病人数已达2.9亿，其中冠心病1100 万，已成为重大的公共卫生问题[2]。冠心病具有高发病率、高致死率的特点，目前冠心病的治疗主要包括抗血小板聚集、降低血脂、抑制交感神经和肾素-血管紧张素-醛固酮系统，而缺乏针对冠心病慢性炎症反应机制的治疗。因此，寻找有效的干预冠心病慢性炎症反应机制的药物并阐明其作用途径和靶点对于冠心病的防治具有重要的临床意义。

辅助性T 细胞17（T helper cell 17,Th17）是一种能分泌白介素17（interleukin 17, IL-17）的T 细胞亚群，其存在于小鼠和人类的动脉粥样硬化病变中，具有强烈的促进炎症反应作用，可加速粥样硬化斑块进展和导致斑块稳定性下降[3-5]。因此，Th17细胞分化在冠心病中致为关键，在慢性炎症情况下，IL-6 大量产生，促进CD4+T 细胞向Th17 分化，同时抑制调节性T 细胞的产生，介导机体的前炎症反应。已知与Th17细胞分化密切相关的两条通路，即TGFβ 信号通路和JAK/STAT信号通路，通过直接或间接作用促进Th17细胞分化。

冠心病属于中医胸痹心痛病范畴，其主要的病理因素分为虚实两方面，其中气虚和血瘀是最主要的两个证候要素，气虚血瘀证型也是最常见和最主要的证型。芪参益气滴丸（Qishen Yiqi pill,QSYQ）是临床治疗冠心病心绞痛、心肌梗死、心力衰竭的现代中药，其主要成分包括黄芪、丹参、三七、降香油，具有益气通脉、活血止痛的作用[6-7]。我们的前期研究显示，芪参益气滴丸可通过减少斑块和脾脏中IL-17的蛋白表达从而抑制动脉粥样硬化。但对Th17 细胞分化的作用途径和靶点需要进一步研究。本研究以Th17 细胞分化为研究对象，首先通过网络药理学方法分析芪参益气滴丸有效成分作用于Th17 细胞分化的作用途径和靶点，其次证实芪参益气滴丸抑制粥样硬化斑块的作用及对TGFβ 信号通路和JAK/STAT 信号通路关键蛋白的作用，从而阐明芪参益气滴丸治疗冠心病的抗炎机制，为临床应用芪参益气滴丸治疗冠心病提供科学支撑。

1 材料和方法

1.1 网络药理学实验

1.1.1 芪参益气滴丸溶出成分分析

根据芪参益气滴丸高效液相色谱-质谱研究发现，19 种化合物在260 nm 处有较强的紫外吸收，27 种化合物在203nm 处有微弱的紫外吸收[8]。并使用PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）对其化合物名称和分子结构进行核对。

1.1.2 芪参益气滴丸有效成分筛选

选择芪参益气滴丸46种成分作为目标化学成分，去除未知成分及非药物成分，按照化合物口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18 或已有文献报道进行筛选（https://tcmsp-e.com/）。

1.1.3 构建芪参益气滴丸有效成分—Th17 细胞靶标网络

将筛选得到的芪参益气滴丸有效成分通过逆向分子对接（使用invdock 和autodock-vina 软件，来源National University of Singapore 和http://vina.scripps.edu/），进而找到相对应的靶标，并进行KEGG 通路富集分析（http://www.bioinformatics.com.cn/），构建芪参益气滴丸有效成分—Th17 细胞靶标网络（http://www.genome. jp/kegg/）。 采 用Cytoscape 软 件（https://cytoscape.org/）进行网络构建、分析和可视化工作。

1.2 动物实验

1.2.1 仪器与试剂

电子天平（型号：ME104E/02，梅特勒托利多仪器上海有限公司），电热恒温鼓风干燥箱（型号：DGG-9203A，上海森信实验仪器有限公司），冰冻切片机（型号：CM 1950，德国Leica Biosystems Nussloch GmbH），倒置显微镜（型号：IX53，日本OLYPUS Corporation），图像拍摄系统（型号：cellSens Standard 1.9，日本OLYPUS Corporation），酶标仪（型号：ZS-3 板式酶标仪，北京市新风机电技术公司），电泳仪（型号：DG-300C，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司），迷你双垂直电泳槽（型号：DYCZ-24DN 型，北京市六一仪器厂），水平摇床（型号：TDK-2 水平摇床，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司），台式高速冷冻离心机（型号：TGL-20M型，长沙湘仪离心机仪器有限公司）。

RIPA 裂解液（货号：WB-0071，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司），PMSF（货号：WB-0181，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司），BCA 蛋白定量试剂盒（货号：BCA01，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司），1.5M Tris-HCL pH8.8（货号：WB-0011，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司），1.0M Tris-HCL pH6.8（货号：WB-0021，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司），30% Acrylamide 丙烯酰胺（货号：WB-0031，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司），SDS 十二烷基硫酸钠（货号：DH286-1.1，GenView 分装），考马斯亮蓝R-250（货号：DH078，USB 公司），Ponceau S丽春红（货号：DH256-1，GenView 分装），PVDF 转印膜（货号：XLL092-2，PALL 公司），ECL 化学发光试剂盒（货号：ECL-0012，PIERCE 公司），通用显影粉（货号：XLL039-1，天津市世纪奥博商贸有限责任公司），通用定影粉（货号：XLL040，天津市世纪奥博商贸有限责任公司）。

芪参益气滴丸（规格：0.5 g/袋，批号：140706，天士力制药股份有限公司），苏丹IV（规格：500 g/瓶，货号：85-83-6，沈阳试三生化科技开发有限公司），抗转化生 长 因 子β 受 体1（Transforming growth factor beta receptor 1，TGF-βR1）抗体（货号：GTX102784，稀释比例：1:500，GeneTex 公司），抗Sma 与Mad 相关蛋白2/3（Sma-and Mad-related protein 2/3，Smad2/3）抗体（货号：SC-8332，稀释比例：1:500，SANTA 公司），抗Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）抗体（货号：ab32101，稀释比例：1:5000，Abcam 公司），抗信号转导和转录激活因子3（Signal transducer and activator of transcription，STAT3）抗体（货号：ab76315，稀释比例：1:10000，Abcam 公司），抗维甲酸相关孤儿受体α（Retinoidrelated orphan receptor α，RORα）抗 体（货 号：GTX100029，稀释比例：1:2000，GeneTex 公司），抗维甲酸受体α（Retinoic acid receptor α，RARα）抗体（货号：ab76074，稀释比例：1:500，Abcam 公司），抗β-肌动蛋白（β-Actin）抗体（货号：AC001-M，稀释比例：1:5000，SANTA公司）。

1.2.2 动物

健康雄性SPF 级ApoE 基因敲除小鼠（品系C57BL/6J），7 周龄，体质量21-23 g，购自北京华阜康生物科技股份公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2014-0004。小鼠饲养于22℃和50%相对湿度的空调环境中，12 h 光照与12 h 黑暗循环。动物实验过程获得贵州中医药大学实验动物伦理委员会批准，并按实验动物使用的3R 原则给予人道关怀。所有的动物处置都符合国际实验动物照料和使用指南[9]。

1.2.3 实验设计

ApoE基因敲除小鼠分为三组：模型组（Model）、芪参益气滴丸低剂量组（QSYQ low）、芪参益气滴丸高剂量组（QSYQ high），每组各6只小鼠。各组小鼠均于实验第1 天给予高脂饲料喂养（高脂配方：基础饲料79%，猪油21%，胆固醇0.15%。购自北京博泰宏达生物技术有限公司），持续喂养8周。芪参益气滴丸治疗组于实验第1天给予低剂量或高剂量的药物（0.3 g/kg/天或1.5 g/kg/天），模型组给予等体积的生理盐水。给药8 周后取材，用10%水合氯醛（货号：302-17-0，Merck 公司）进行腹腔注射，收集腹主动脉血液并处死小鼠，再经心脏灌注20 mL 的1×PBS（货号：17202，Millipore公司）后取出心脏和主动脉。

1.2.4 病理形态学染色及测量

为了评价各组动脉粥样硬化损伤程度，我们将主动脉根部包埋于最佳切割温度复合物（Optimal cutting temperature compound，OCT）冰冻切片包埋剂中，并储存于-80℃超低温冰箱中。然后对主动脉根部行连续冰冻切片（10 μm），每隔10 张切片进行苏丹IV 染色，采用图像拍摄系统在100 倍和400 倍镜下进行摄片，用Image J软件定量测量动脉粥样硬化损伤面积，各组按主动脉根部每隔100μm 切片的阳性染色面积进行比较。

1.2.5 蛋白质免疫印迹实验

将主动脉研碎，使用RIPA 裂解液，裂解液中加入PMSF（1 mM），对主动脉细胞进行裂解，然后将蛋白质提取物置于放射免疫沉淀分析缓冲液中进行分离，蛋白质浓度采用二喹啉甲酸方法进行测量（在振荡器上振荡30 s，37℃放置30 min，然后在562 nm 下测定OD值）。蛋白质上清液（80 μL）在10%十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶上进心电泳分离（恒压80 V 预电泳10 min 至溴酚蓝前沿到达分离胶，将电压调整到恒压

120V，电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部），然后转移到硝化纤维素膜上。目标蛋白质采用抗靶标蛋白抗体进行孵育（室温下摇床缓慢摇荡孵育1-3 h 或者4℃过夜孵育），然后用相应二抗进行孵育（室温摇床孵育2 h）。增强化学发光成像法用于蛋白质条带的检测。使用Quantity One 软件进行半定量分析，数据用目标蛋白/β-actin的比值表示。

1.2.6 统计学方法

所有数据均符合正态分布，数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用最小显著差异（Least significant difference，LSD）法，统计软件为统计产品与服务解决方案11.5（Statistical Product and Service Solutions 11.5，SPSS 11.5），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 芪参益气滴丸有效成分及作用靶点数量

我们根据芪参益气滴丸高效液相色谱-质谱研究结果确定其主要成分，并使用PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）对其化合物名称和分子结构进行核对，根据口服利用度（OB）、类药性（DL）或已有文献报道筛选出有效成分，包括黄芪甲苷、三七皂苷R1、丹酚酸B、丹酚酸A、丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、毛蕊异黄酮、刺芒柄花素7-羟基-4′-甲氧基异黄酮等11 个成分（表1）。将芪参益气滴丸有效成分跟人类和哺乳动物的蛋白质库进行经过逆向分子对接，哺乳动物的对接得到的蛋白质根据blast 对比到人类的蛋白质库中。结果分为三组，一组是只有在invdock 中对接到的蛋白，一组是只有在autodock-vina 中对接上的蛋白，一组是invdock 和autodock-vina 结果相互重合的部分（结果最准确）。各成分最终靶点数量分别为114、29、28、25、17、13、29、35、31、14、21（表2）。

表1 芪参益气滴丸中筛选出的化合物基本信息

表2 芪参益气滴丸有效成分及作用靶点数量

2.2 芪参益气滴丸有效成分对Th17 细胞分化通路的影响

我们选择芪参益气滴丸11 个有效成分作为目标化学成分，从Pubchem 数据库下载这些成分的化学结构，通过逆向分子对接找到相对应的靶标，并进行京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析（图1），构建芪参益气滴丸有效成分—Th17 细胞靶标网络（hsa04659）。结果显示，25 个与Th17 细胞分化相关蛋白被确认为靶点蛋白，其中作用成分超过10 个的靶点蛋白有：CD4、TGFβR、SMADs、白介素-2（Interleukin-2，IL-2）、RARα、维甲酸X 受体（Retinoic acid X receptor，RXR）。多条信号通路，如TGF-β 信号通路、JAK/STAT 信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路、低氧诱导因子-1（Hypoxia inducible factor-1,HIF-1）信号通路、钙信号通路、核因子κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）信号通路等参与了芪参益气滴丸干预Th17 细胞分化过程（图2、表3）。

图1 芪参益气滴丸有效成分作用靶点KEGG通路富集图

图2 芪参益气滴丸有效成分对Th17细胞分化通路的作用靶点

表3 芪参益气滴丸作用于Th17细胞分化通路关键蛋白的成分数量及名称

2.3 芪参益气滴丸对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块面积的影响

为了评价芪参益气滴丸对动脉粥样硬化进展的影响，我们对动脉粥样硬化小鼠主动脉根部进行苏丹IV 染色及定量分析，各组每隔100 μm 切片的阳性染色面积进行比较（图3）。结果显示，模型组小鼠在主动脉根部形成粥样硬化斑块，内膜明显增厚，含有大量脂滴沉积，结构较为疏松，斑块面积约为80-180×103μm2。在主动脉根部100 -300μm 距离上，芪参益气滴丸低剂量、高剂量均能明显减小斑块绝对面积（与模型组比较P＜0.05），而且呈现一定的剂量依赖特征，但在400 μm距离上，芪参益气滴丸高、低剂量组在减少斑块面积上无明显差异，考虑与400 μm处斑块距脂质核心较远、脂肪含量少有关。

图3 芪参益气滴丸对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块面积的影响

2.4 芪参益气滴丸对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化中Th17细胞靶点蛋白表达的影响

Th17 细胞的主要效应细胞因子是IL-17，通过促进单核-巨噬细胞侵入动脉壁从而加速动脉粥样硬化进程[19]。我们选择了已知与Th17 细胞分化密切相关的两条通路TGFβ 信号通路、JAK/STAT 信号通路进行蛋白表达验证（图4）。结果显示，模型组中TGFβR1/Smad2/3、JAK2/STAT3、RORα、RARα 等蛋白均有明显表达。与模型组相比，芪参益气滴丸低剂量组和高剂量组均可增加粥样硬化动脉中TGFβR1 的表达（P＜0.05），芪参益气滴丸高剂量组还可增加Smad2/3 的蛋白表达（P＜0.05），提示芪参益气滴丸可通过促进TGFβR1/ Smad2/3 信号通路间接减少CD4+ T 细胞向Th17细胞分化。同时，芪参益气滴丸高低剂量组与模型组比较均可抑制JAK2、STAT3、RORα 的蛋白表达（P＜0.05），但对RARα 的表达无显著影响（P＞0.05），提示芪参益气滴丸通过抑制JAK2/STAT3 信号通路直接减少CD4+T细胞向Th17细胞分化。

图4 芪参益气滴丸对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化中Th17细胞靶点蛋白表达的影响

3 讨论

本研究探讨芪参益气滴丸对动脉粥样硬化ApoE基因敲除小鼠模型的作用，结合网络药理学技术、病理学技术、分子生物学技术等，首次证实了芪参益气滴丸抑制粥样硬化斑块中Th17 细胞的信号途径和作用靶点，从而阐明其抑制动脉粥样硬化的作用机制。

芪参益气滴丸抗动脉粥样硬化机制包括：降低血脂，升高肝组织肝酯酶活性，降低高敏C 反应蛋白水平，上调TGF-β1 表达等[20-22]。我们的前期研究显示，芪参益气滴丸可显著减少动脉粥样硬化小鼠肝指数、抑制斑块中CD36 表达、增加肝脏X 受体α（Liver X receptor-α,LXR-α）、ATP 结合盒子系列G 成员5 表达（ATP-binding cassette transporter G member 5，ABCG5），促进胆固醇从肝脏排泄，其抑制粥样硬化作用还与增加斑块中调节性T细胞关键蛋白叉头状转录因子3（Forkhead transcription factor p3，Foxp3）表达、减少Th17 细胞IL-17 细胞因子表达有关[23]。本研究证实，不同剂量芪参益气滴丸均可显著抑制动脉粥样硬化小鼠主动脉根部粥样硬化斑块的面积，而且呈现一定的剂量依赖特征。

Th17 细胞是由幼稚型CD4+T 细胞分化而来。在TGF-β 单独的作用下，活化的幼稚型CD4+T细胞分化为调节性T 细胞，而在TGF-β 和IL-6 的共同诱导，通过STAT3 向Th17 分化[24-27]。Th17 产生的主要效应因子是IL-17，IL-17 可诱导促炎细胞因子（如IL-6，TNF-α 等）、趋化因子（如巨噬细胞趋化蛋白-1）和基质金属蛋白酶的表达。在动脉粥样硬化条件下，血清IL-17 水平显著升高，而氧化低密度脂蛋白通过增加IL-6 的分泌，诱导了树突状细胞介导的Th17 细胞极化，提示促动脉粥样硬化因素可促进Th17 的炎症功能[3,28-29]。动物实验证实，Th17 细胞的比例在动脉粥样硬化小鼠中明显增高，而其表达的IL-17 和维甲酸相关孤儿受体γt在斑块动脉显著高于非斑块动脉[30]。利用肺炎衣原体磷脂酶D 刺激可以通过诱导化学因子和粘附分子的表达，进而促进Th17 细胞的迁移和IL-17 的分泌，加速动脉粥样硬化进展[31]，而通过阻断IL-17A 可以明显减少循环IL-6 和集落刺激因子水平，并抑制动脉趋化因子配体1 的表达和巨噬细胞的浸润，减轻动脉粥样硬化损伤程度[32]。

芪参益气滴丸作为现代中药复方，组成药物多，成分复杂，我们采用网络药理学方法，确定了其主要有效成分，再利用逆向分子对接技术，找到了其影响Th17 细胞分化的作用靶点。25 个与Th17 细胞分化相关蛋白被确认为靶点蛋白，多条信号通路参与了芪参益气滴丸干预Th17 细胞分化过程。其中，已知与Th17 细胞分化密切相关的两条通路：TGFβ 信号通路和JAK/STAT 信号通路，其关键蛋白TGFβR1、Smad2/3、JAK2、STAT3、RORα 被证实可被芪参益气滴丸调节。芪参益气滴丸可通过两条途径减少Th17 细胞数量：一是促进TGFβR1/Smad2/3 蛋白表达，促使CD4+T细胞更多的向调节性T 细胞分化，间接减少Th17 细胞数量；二是通过抑制JAK2/STAT3 蛋白表达，直接减少CD4+T细胞向Th17细胞分化。

综上所述，芪参益气滴丸可通过干预TGFβ 信号通路和JAK/STAT信号通路，减少Th17细胞分化，抑制Th17 细胞主要效应因子IL-17 的分泌，抑制粥样硬化斑块炎症反应及脂质沉积。