补肾活血方对人胚肺成纤维细胞IL-17A、LC3-Ⅱ影响的实验研究＊

刘晓明，李 芮，高善语

（山东中医药大学附属医院 济南 250014）

特发性肺纤维化（Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一种发病机理不明确的间质性肺疾病，目前临床缺乏有效治疗方法及药物。其中，细胞外基质的过度沉积是肺纤维化的主要病理改变[1-2]，而细胞自噬正是保护细胞稳态的重要途径，近来有研究发现细胞自噬调节与肺纤维化的发病密切相关，自噬受损还诱导更高的炎症反应并增加胶原蛋白的积累，自噬-溶酶体降解途径则是肺纤维化中降解胶原的主要途径[3]，提示自噬调节失调可能是肺纤维化发病的重要机制之一，而靶向调控自噬有望成为肺纤维化的诊疗新靶点和方向。有研究发现白介素17A 型细胞因子（Interleukin-17，IL-17A）能够通过活化stat3 信号途径调节自噬相关核心复合物组分表达与活化，进而自噬小体的活性被抑制，进一步干预细胞内外胶原蛋白的纤溶及降解。而在多项实验中发现在多种组织纤维化模型中阻断IL-17A 能够使纤维化组织中受损的自噬活性得到显著恢复，进而阻断多种组织纤维化的进展。由此提出抑制IL-17A可激活自噬活性，延缓各种纤维化的发生及发展。进而我们推测阻断IL-17A 靶向调控自噬有望成为肺纤维化的诊疗新靶点和方向。补肾活血方为经临床验证对肺纤维化有确切疗效的中药处方，前期通过网络药理学研究发现该方的临床疗效可能与IL-7A 以及细胞自噬有密切相关性，因此设计该体外实验，观察补肾活血方对纤维化模型中COL-I（I 型胶原蛋白，Collagen I）、IL-17A 及自噬小体含量的影响，探讨补肾活血方在肺纤维化中的作用靶点。为下一步体内实验指明方向，为明确具体的信号通路奠定基础。本实验具体流程图见图1。

图1 实验流程图

1 实验材料

1.1 实验细胞株和主要试剂

人胚肺成纤维细胞MRC-5（赛百慷上海生物技术股份有限公司）；TGF-β1（转化生长因子-β1，Transforming growth factor-β1）（MCE中国）。

1.2 主要实验仪器设备

超净工作台（苏州净化SW-CJ-IFD）；HERACELL 150i 二氧化碳恒温培养箱（日本SANYO 公司XD-101）；显微镜（日本OLYMPUS公司IX51）；台式低速离心机（广州吉迪仪器有限公司）；高速冷冻离心机（德国eppendorf 公司5024R）；酶标仪（山东恒美电子科技有限公司）；EPS-300 水平电泳仪（赛默飞世尔科技中国）；VE-186蛋白转膜仪（赛默飞世尔科技中国）；VE-180蛋白电泳仪（赛默飞世尔科技中国）。

2 实验方案

2.1 补肾活血方血清制备

2.1.1 补肾活血方中药汤药制备

课题组于济南市西岭角养殖中心购入新西兰兔20 只，雄性，体质量2.75±0.25 kg（SCXK(Lu) 201501）。将上述新西兰兔饲养于山东省中医院动物实验中心。所有新西兰兔在实验过程中均可自由进食和饮水。将8 倍新西兰兔等效剂量的中药准确称取，加入8 倍量的水浸泡后煎煮，药液过滤浓缩，浓度为5 g·mL-1（生药量），置4℃冰箱保存备用[1]。

2.1.2 制备过程

健康新西兰兔随机分为含药血清组和正常血清组。

以56 g·kg-1生药量对新西兰兔进行灌胃。在灌胃前，对新西兰兔禁食12 h，其中含药血清组1 日灌胃2次11.2 mL/（kg·天），正常血清组以等体积0.9% NaCl灌胃1日2次。连续灌胃给药7天，在末次给药1 h后，对仍处在自然意识状态下的新西兰兔，腹腔注射1%利多卡因5 mL，取腹主动脉血。将所取血液置于37℃下放置1 h。血凝后，5000 r/min 离心10 min。分离血清，将同组血清混合，并灭活补体。然后使用0.22 μm醋酸纤维素膜对血清进行过滤和消毒，在-20°C 下保存以备将来使用[1]。

2.2 实验细胞的培养

MRC-5 细胞被置于5% CO2、37℃培养箱中，在添加10%胎牛血清的不完全DMEM 培养基（Dulbecco′s modification of Eagle′s medium Dulbecco，改良Eagle 培养基）中生长，并以传代后状态较好的第3-4代细胞进行实验。

2.3 实验分组及药物干预

参照文献[3]及预实验结果，确定TGF-β1 诱导MRC-5细胞活化的最佳浓度为5 ng·mL-1，最佳刺激时间为48 h。

2.3.1 实验分组一

对照组，不同稀释倍数的含药血清组（1 倍、1/2倍、1/4倍、1/8倍、1/16倍、1/32倍、1/64倍、1/128倍）。

2.3.2 实验分组二

空白对照组，TGF-β1处理组，TGF-β1处理+最佳浓度含药血清干预1 h 组（含药血清组），TGF-β1 处理+基因敲除阴性对照组（sh-NC 组），TGF-β1 处理+IL-7A 基因敲减组（sh-IL-17A 组），TGF-β1 处理+最佳浓度含药血清干预1 h+过表达质粒阴性对照组（Vector 组），TGF-β1 处理+最佳浓度含药血清干预1 h+IL-17A过表达质粒组（IL-17AOE组）。

2.4 MTT法测定各组对MRC-5细胞增殖的抑制情况

将细胞随机分为9组，包括正常组（正常DMEM培养基）及不同稀释浓度含药血清干预组。各组细胞置于培养箱中（37℃5%CO2）培养24 h，弃去旧培养液，每孔加入20 μL MTT 液（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐），继续在培养箱中孵育4 h，弃去MTT液，加入DMSO，震荡摇匀后在避光孵育15 min，酶标仪读取波长490 nm 处各孔OD 值并记录，实验重复3次[1]。

2.5 CCK8（Cell Counting Kit-8）法检测含药血清对MRC-5细胞增殖的影响

MRC-5 细胞以1×105/孔接种于96 孔微量滴定板，除空白对照组外，其余各组加入TGF-β1 诱导48 h。然后更换100 μL新培养基，加入10%CCK8，于培养箱中培养4 h，用酶标仪在450 nm 测各组OD 值，实验重复3次[1]。

2.6 RT-qPCR 技术（Real time Quantitative PCR，实时荧光定量）检测含药血清对MRC-5 细胞中IL-17A 含量的影响

用超纯RNA提取试剂盒提取样本中总RNA，采用RT-qPCR 方法检测mRNA 的表达水平，以GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，甘油醛-3-磷酸脱氢酶）作为内参基因。表1-表2 为引物序列。

表1 IL-17A引物序列

表2 COL-Ⅰ引物序列

2.7 Western blot（蛋白质印迹法）检测COL-Ⅰ、IL-17A、LC3Ⅱ（膜型自噬体）含量的变化

抽提总蛋白，具体操作按试剂盒说明进行。最后放入凝胶成像仪中显影。

2.8 统计学方法

应用SPSS 21.0软件分析实验数据，应用单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行具体分析，组间比较结果以平均值±标准差（±s）的形式表示，P＜0.01 表明差异具有显著统计学意义，P＜0.05 差异具有明显统计学意义。

3 实验结果及分析

3.1 最佳浓度含药血清的选择

3.1.1 各组含药血清对MRC-5细胞的抑制情况

由图2 可见，当含药血清稀释至0.0625 倍（1/16）时，细胞抑制率为10.06%，该药物浓度下，细胞抑制率较低，对细胞损伤小，相对安全，故将含药血清浓度稀释至0.0625倍定为本实验的药物最大无毒浓度。

图2 各组对MRC-5细胞增殖的抑制情况

3.1.2 Western blot法检测各组COL-I 蛋白含量情况

由图3 显示，组间分析显示，MRC-5 细胞加入含药血清干预后，细胞内COL-ⅠmRNA 表达最大无毒浓度组（a组）降低最明显。

图3 不同浓度含药血清对细胞内COL-Ⅰ蛋白含量的影响

3.2 含药血清对MRC-5细胞增殖的影响

表3 显示，与空白对照组比较，TGF-β1 处理组的MRC-5 细胞增殖水平显著增加（P＜0.01），增殖率为15.21%。

表3 含药血清对MRC-5细胞增殖的影响（±s）

表3 含药血清对MRC-5细胞增殖的影响（±s）

注：▲与空白组相比较，P＜0.01；▼与模型组相比较，P＜0.01。

组别空白对照组TGF-β1处理组含药血清组sh-IL-17A组IL-17AOE组OD值2.493±0.213 3.198±0.137▲2.473±0.086▼2.480±0.123▼3.215±0.126增殖抑制率（%）22.67 22.45

3.3 各组MRC-5细胞中IL-17A mRNA的表达量

3.3.1 含药血清组与TGF-β1 处理组、空白对照组MRC-5细胞中的IL-17A mRNA表达量比较

表4、图4 中，TGF-β1 处理组与空白对照组MRC-5 细胞中的IL-17A mRNA 表达量比较（P＜0.05），含药血清组与TGF-β1 处理组MRC-5 细胞中的IL-17A mRNA表达量比较（P＜0.01）。

表4 含药血清对IL-17A mRNA表达量的影响（±s）

表4 含药血清对IL-17A mRNA表达量的影响（±s）

注：▲与空白组相比较，P＜0.05；▼与模型组相比较，P＜0.05。

组别空白对照组TGF-β1处理组含药血清组IL-17A mRNA表达量1.030±0.282 9.756±1.560▲1.907±0.679▼

图4 含药血清对IL-17A mRNA表达量的影响

3.3.2 sh-NC 组与sh-IL-17A 组MRC-5 细胞中IL-17A mRNA表达量比较

表5、图5 中，sh-NC 组与sh-IL-17A 组MRC-5 细胞中的IL-17A mRNA表达量比较（P＜0.01）。

图5 IL-17A基因敲除后IL-17A mRNA表达量的影响

表5 IL-17A基因敲除后IL-17A mRNA表达量的影响（±s）

表5 IL-17A基因敲除后IL-17A mRNA表达量的影响（±s）

注：▼与sh-NC组相比较，P＜0.05。

组别sh-NC组sh-IL-17A组IL-17A mRNA表达量1.008±0.128 0.471±0.072▼

3.3.3 IL-17AOE 组与Vector 组MRC-5 细胞中的IL-17A mRNA表达量比较

表6、图6 中，IL-17AOE 组与Vector 组MRC-5 细胞IL-17A mRNA表达量比较（P＜0.01）。

图6 IL-17A质粒过表达后对IL-17A mRNA表达量的影响

表6 IL-17A质粒过表达后对IL-17A mRNA表达量的影响（±s）

表6 IL-17A质粒过表达后对IL-17A mRNA表达量的影响（±s）

注：▼与Vector组相比较，P＜0.05。

组别Vector组IL-17AOE组IL-17A mRNA表达量1.011±0.199 6.730±1.271▼

3.4 各组MRC-5细胞中COL-Ⅰ、IL-17A蛋白含量情况

COL-Ⅰ：图7 显示，含药血清组细胞中COL-Ⅰ蛋白含量较TGF-β1处理组明显降低；sh-IL-17A组细胞中COL-Ⅰ蛋白含量较sh-NC 组明显减少，而IL-17AOE 组细胞中COL-Ⅰ蛋白含量较Vector 组明显增加。

IL-17A：图7 显示，TGF-β1 处理组细胞中IL-17A蛋白含量量较空白对照组明显增多，而含药血清组细胞中IL-17A 蛋白含量较TGF-β1 处理组明显减少；sh-IL-17A 组细胞中IL-17A 蛋白含量较sh-NC 组明显减少，而IL-17AOE 组细胞中IL-17A 蛋白含量较Vector组明显增加。

图7 各组MRC-5细胞中COL-Ⅰ、IL-17A蛋白含量情况

3.5 各组MRC-5 细胞中自噬小体LC3-Ⅱ蛋白含量情况

图8 激光共聚焦显微镜下观察自噬小体的形态

图8、图9 显示，与TGF-β1 处理组比较，含药血清组细胞中LC3-Ⅱ蛋白含量明显增多；与sh-NC 组比较，sh-IL-7A 组细胞中LC3-Ⅱ蛋白含量增多，而与Vector 组比较IL-7AOE 组细胞中LC3-Ⅱ蛋白含量明显减少。

图8 激光共聚焦显微镜下观察自噬小体的形态

图9 各组溶液对MRC-5细胞内自噬小体LC3-Ⅱ蛋白表含量情况

4 讨论

研究表明，肺间质纤维化的形成与炎症反应、氧化应激、细胞因子异常释放、免疫系统失调、微循环障碍及细胞增殖、重构等有关[4]，最终导致细胞外基质（即不溶性纤维蛋白）的过度沉积或者分解减少[2]。有研究发现阻断IL-17A 的活性，激活细胞自噬，能够阻断胶原蛋白的异常沉积。因此，IL-17A可能成为肺纤维化治疗的新靶点。

IL-17 是一种细胞因子，家族中最具代表性的成员IL-17A，一方面会诱导炎症因子以及趋化因子的表达，另一方面会诱导一些组织修复相关因子的表达加速机体的恢复[5]。过高的IL-17A水平对于疾病的病理发展起到恶化作用。2010年，Wilson等人发现IL-17A的受体被敲除后，由博莱霉素诱导的肺组织纤维化程度得到显著改善[6]。近年来有研究表明，IL-17A 还可以通过非TGF-β1 依赖途径抑制自噬活化，进而抑制胶原降解[7-9]。因此，IL-7A 可能成为治疗肺纤维化的潜在靶点，阻断IL-17A的活性为其关键路径。其中一条为IL-17A 的自噬活化机制，阻断IL-17A 能够抑制Vps34（Ⅲ型磷酸肌醇3-激酶，PI3K），进而通过GSK3β信号通路激活抑制性蛋白Bcl-2（B-cell lymphoma-2，B 淋巴细胞瘤-2）的ser70 位的磷酸化，抑制Bcl-2 与Beclin-1（programmed cell death-1，程序性死亡受体-1）结合，最终促进自噬活化，增加胶原蛋白的降解。自噬主要通过调节胶原降解和细胞凋亡来控制或者延缓肺纤维化的进展[10-11]。许多研究报道认为纤维化肺细胞中的自噬活性是降低的、促纤维化反应是激活的[12]。在肺纤维化患者的肺组织中可检测到自噬小体，应用具有生物活性的自噬小体来评价自噬的活性[13-16]。自噬核心复合物（Bcl-2、Beclin-1、Vps34、Vps15、Atg14 以及Ambral 等）在自噬的活化过程中发挥了极其重要的作用，当Bcl-2 与Beclin-1 结合时，自噬被抑制;当Bcl-2 与Beclin-l 解离时，自噬被活化[17-18]。因此，Bcl-2 与Beclin-1 结合与否，是自噬活化的关键。因此，研究有效药物通过抑制Bcl-2 与Beclin-1的结合，自噬活性被活化，进一步降解肺组织中胶原成分，阻断甚至逆转组织纤维化，为治疗肺纤维化疾病提供新的治疗思路。

课题组应用李芮教授治疗肺纤维化的协定方补肾活血方（人参9 g，黄芪30 g，熟地黄15 g，山茱萸9 g，麦冬15 g，五味子6 g，当归15 g，丹参15 g，黄芩15 g，川贝母6 g，虎杖18 g，炙甘草6 g），以传统中医理论为指导进行了一系列的临床及实验研究。其中2011 年在对慢阻肺合并肺纤维化的临床观察中发现，该方对老年患者的症状、体征有显著改善作用，同时能够升高随增龄而降低的IgM，调节免疫球蛋白的改变，同时对炎症指标CRP 亦有明显的降低作用。因此可以从中看出补肾活血方治疗肺纤维化可能通过调节免疫、减轻炎症反应等方面来实现的[19]。而近年来在对该方的进一步临床研究发现，补肾活血方治疗IPF 疗效确切，既能够改善肺内换气功能、提高动脉血携氧能力、调节氧化/抗氧化失衡、减轻抗炎症反应，同时还抑制胶原蛋白异常沉积，从而达到治疗IPF 的良好疗效[20]。方中以人参、黄芪、麦冬、熟地黄以补肺益肾，共为君药；山茱萸、五味子上敛肺气、下固肾精，共为臣药；佐以当归、丹参活血通络，黄芩、虎杖以清泻肺热，川贝母、炙甘草祛痰止咳，六药合用共祛瘀、痰、热毒；炙甘草兼为使药，以调和诸药。“补肾活血方”对正气亏虚、痰瘀毒聚所致的肺纤维化具有显著的临床疗效。

基于以上研究基础，我们提出假说：补肾活血方扶正、祛瘀、化痰、解毒，减少胶原蛋白的异常沉积是其治疗肺间质纤维化的关键环节，其机制可能与IL-17A/PI3K/GSK3β信号通路调控细胞自噬密切相关。

根据图10 假说我们课题组进行了一系列相关实验研究，基于详细的实验数据分析可知：

图10 课题假说图

首先，通过测定不同浓度含药血清对MRC-5细胞增殖的抑制情况，选取含药血清的最大无毒浓度。组间分析显示，最大无毒浓度组（a 组）降低最明显（P＜0.01），a、b组与对照组两两比较差异性显著，具有统计学意义，c、d组无明显差异。因此最终选定a组浓度为本研究的最佳有效浓度。

其次，TGF-β1 处理组MRC-5 细胞的增殖率及COL-Ⅰ的蛋白表达量明显高于空白对照组，说明应用TGF-β1作用MRC-5细胞造模成功。

第三，与TGF-β1 处理组比较，含药血清组和sh-IL-17A 组细胞增殖水平均降低（P＜0.01），且两组之间细胞增殖率无明显差异（P＞0.05）；而IL-17AOE 组细胞增殖水平与TGF-β1 处理组相似，两组之间无明显差异（P＞0.05）。同时与TGF-β1 处理组比较，含药血清组细胞中COL-Ⅰ的蛋白含量明显降低，sh-IL-17A组细胞中COL-Ⅰ蛋白含量较sh-NC 组明显减少，而IL-17AOE组细胞中COL-Ⅰ蛋白含量较Vector组明显增加。说明含药血清能够明显的降低MRC-5 细胞中胶原蛋白的含量，也可以说补肾活血方可有效的降低MRC-5细胞内的胶原蛋白的含量，其作用途径可能与阻断IL-17A通路有关。

第四，各组IL-17A mRNA表达量及蛋白含量比较中可以看出，而含药血清组细胞中IL-7A mRNA 表达量及IL-17A 蛋白含量较TGF-β1 处理组明显减少，且sh-IL-17A组细胞中IL-7A mRNA表达量及IL-17A蛋白含量较sh-NC 组明显减少。IL-17AOE 组细胞中IL-7A mRNA 表达量及IL-17A 蛋白含量较Vector 组明显增加。进一步验证了该方是通过阻断IL-17A 通路而起到治疗肺纤维化作用的。

第五，在各组MRC-5 细胞内自噬标记蛋白LC3-Ⅱ含量比较中发现，TGF-β1 组较空白对照组MRC-5细胞中的LC3-Ⅱ蛋白含量降低，而与TGF-β1 处理组比较，含药血清组细胞中LC3-Ⅱ蛋白含量明显增多与sh-NC组比较，sh-IL-7A组细胞中LC3-Ⅱ蛋白含量增多，而与Vector组比较IL-7AOE组细胞中LC3-Ⅱ蛋白含量明显减少。进一步说明了补肾活血方治疗肺纤维化是通过阻断IL-17A 通路、激活细胞自噬、降解胶原蛋白而实现的。

总之，通过本实验我们发现，补肾活血方主要是通过阻断IL-17A、激活细胞自噬、进而降解胶原蛋白来实现对肺间质纤维化的治疗作用。该实验是山东中医药科技发展计划的一项在研课题，也是济南市科技局临床医学科技创新计划课题的一部分，该实验主要是以MRC-5细胞为研究对象，通过相关指标检测准确找到中药复方（补肾活血汤）靶向治疗的分子靶点，是本项目的创新，为下一步动物实验指明研究方向，为进一步明确具体的信号通路奠定基础，并详细阐释中药复方的靶向治疗机理，为临床应用中药治疗IPF提供新的方法及理论支持。