液质联用技术联合网络药理学探讨白鲜皮治疗湿疹的作用机制＊

石 芸，徐 华，徐长丽，金俊杰，秦昆明＊＊，高 珣，李伟东＊＊

（1. 南京中医药大学药学院 南京 210046；2. 江苏海洋大学药学院 连云港 222005；3. 南京海源中药饮片有限公司 南京 210061）

1 引言

白鲜皮为芸香科植物白鲜Dictamnus dasycarpusTurcz.的干燥根皮，味苦，性寒，有清热燥湿，祛风解毒之功效。国内外研究发现，白鲜皮中主要含有柠檬苦素类、黄酮类、生物碱类和挥发油类成分[1]。白鲜皮中柠檬苦素类成分具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎等多种药理活性[2]。生物碱类成分有着良好的抗炎作用，如白鲜碱对炎症反应有一定的抑制作用[3]。课题组前期研究发现，白鲜皮挥发油中烯烃类成分相对含量最高，以单萜类成分为主，其次是倍半萜类成分[4]，这类化合物与白鲜皮的抑菌、抗肿瘤和抗炎活性有关[5]。

白鲜皮临床常用于湿疹等多种皮肤病的治疗，疗效确切。裴小平等研究发现，不同浓度白鲜皮提取液均可改善湿疹模型小鼠的皮肤损害，而高浓度的白鲜皮提取液与地塞米松洗剂效果相当；其机制可能与下调炎症因子IL-17 和IL-22、上调IL-10 的表达相关[6]。杨旭等[7]以大鼠白鲜皮组与模型组比较，大鼠的皮损评分明显下降，湿疹临床表现为红斑、丘疹、抓痕/剥脱均出现减轻的现象。同时指出白鲜皮治疗湿疹具有独特的优势，但现阶段白鲜皮治疗湿疹作用机制没有得到充分研究。为了进一步研究揭示白鲜皮临床用于治疗湿疹的药效物质基础与作用机制，本文采用液质联用技术（LC-MS）分析白鲜皮中主要成分组成，采用网络药理学结合分子对接技术研究主要潜在活性成分的作用靶点和作用通路，从而阐明其药效作用机制。

2 研究思路与方法

通过液质联用技术（LC-MS）对白鲜皮主要成分进行分析，结合文献质谱数据，进行成分快速识别鉴定；利用SwissADME 数据库对白鲜皮潜在活性成分进行预测，筛选与治疗湿疹作用相关的主要作用靶点，并采用分子对接技术对主要成分和作用靶点进行验证。对关键靶点进行KEGG 通路富集分析，最终得到成分-靶点-疾病-通路网络图（图1）。

图1 研究流程图

3 研究与分析

3.1 材料与方法

3.1.1 材料与试剂

白鲜皮饮片选购自南京海源中药饮片有限公司（批号：170101；产地：内蒙古）经南京海源中药饮片有限公司执业中药师丁斐鉴定为芸香科植物白鲜Dictamnus dasyarpusTurcz.的干燥根皮。乙腈、甲醇（美国Tedia 公司，色谱纯），甲酸（上海凌峰，分析纯），其余试剂均为市售分析纯。

3.1.2 仪器与设备

LCMS-2020 高效液相色谱-电喷雾质谱联用仪（日本岛津公司，ESI 电喷雾离子源），配置LC-20AD泵、CTO-20A 柱 温 箱、SIL-20A 自 动 进 样 器、SPDM20A 二极管阵列检测器。AG-285 型万分之一电子天平（瑞典METTLER TOLEDO）、R-210型旋转蒸发仪（瑞士BUCHI）、HH-6数显恒温水浴锅。

3.1.3 样品溶液的制备

称取白鲜皮粉末1 g，加甲醇30 mL，超声处理30 min，滤过，药渣加甲醇30 mL 再超声提取一次，过滤，合并两次滤液，减压蒸干，残渣加甲醇溶解，定容至10 mL，作为供试品溶液，备用。

3.1.4 LC-MS分析条件

色谱条件：采用YMC-Pack ODS-A 色谱柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm），流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）。梯度洗脱程序：0 min，5%B；0-45 min，5%B→30%B；45-55 min，30%B→45%B；55-85 min，45%B→60%B；85-105 min，60%B→90%B；105-110 min，90%B。检测波长：254 nm；柱温35℃，流速1 mL·min-1，进样体积10 μL。

质谱条件：采用电喷雾电离（ESI），离子源温度280℃，毛细管电压4.5kV，检测器电压1.5 kV，干燥气流速5 L·min-1，雾化气流速1.5 L·min-1。正、负离子模式下，获得质谱总离子流图，全扫描质谱范围100-1000 m/z。

3.1.5 白鲜皮潜在活性成分及靶点筛选

通过对白鲜皮质谱数据进行分析，结合中国知网数据库、TCMSP 数据库等平台，鉴定白鲜皮中的主要化学成分。利用SwissADME 对各成分进行筛选，保留胃肠道（Gastrointestinal,GI）吸收评分和生物利用度评分高的成分，作为潜在活性成分。Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）可以用来预测白鲜皮潜在活性成分的作用靶点。将白鲜皮潜在活性成分的MOL 文件，导入软件，设置属性为“Homo sapiens”，预测潜在活性成分的作用靶点。

3.1.6 湿疹相关疾病靶点的获取

在GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/）中，其功能信息包括指向湿疹的关系、突变和多态性、基因表达、基因功能、途径、蛋白质与蛋白质的相互作用等，能较全面获取湿疹相关疾病靶点，分别检索关键词Rubella（风疹）、Eczema（湿疹）、Damp heat sores（湿热疮毒），搜索相关的疾病靶点，根据Relevance score筛选出大于平均值的靶点。

3.1.7 PPI 网络的构建及关键作用靶点分析

将白鲜皮主要成分作用靶点与三种疾病的靶点（风疹Rubella、湿疹Eczema、湿热疮毒Damp heat sores）进行交集，绘制韦恩图得到交集靶点。将交集靶点导入STRING 数据库，得到靶点之间的相互关系，构建PPI网络，导出蛋白相互作用数据。利用Excel 筛选出核心靶标蛋白，利用R 语言绘制关键靶点的柱形图。

3.1.8 KEGG通路富集分析

利用Metascape 软件对交集靶点进行分析，将靶点信息上传后，设置基因物种为“H.sapiens”，采用Express Analysis 进行基因分析，点击Analysis Report Page，下载所有的注释结果（All in One Zip），根据所得结果绘制气泡图。

3.1.9 成分-靶点-通路网络图的构建

筛选出富集靶点蛋白较多的信号通路。将白鲜皮潜在活性成分、关键作用靶点和主要信号通路数据导入到Cytoscape3.7.0 软件，绘制得到成分-靶点-疾病-通路网络图。

3.1.10 主要成分与靶点蛋白的分子对接验证

通 过ZINC（https://zinc. docking. org/substances/home/）下载白鲜皮4 种潜在活性成分的3D 结构。通过PDB 数据库（https://www.rcsb.org/）下载核心靶蛋白数据文件，利用Pymol 软件对蛋白受体进行除去水分子和加氢操作。利用Autodock Vina 软件确定分子对接的坐标和盒子的大小，通过Autodock Tools将处理后的主要潜在活性成分和蛋白质受体分子进行对接。并将结合活性较强的9 个对接结果导入Pymol 软件，绘制成三维图进行可视化展示。

3.2 结果

3.2.1 白鲜皮主要成分的液质联用分析

通过对白鲜皮主要成分进行液质联用分析，得到各主要成分在正负离子模式下的质谱数据。结果显示：白鲜皮主要成分在正负离子模式下均具有较好的响应。其中，正离子模式下的峰数量大于负离子模式。将各成分的质谱数据与文献报道的质谱信息进行对照[8-9]，确定各化合物的分子量，最终鉴定了12 个主要成分，结果见图2和表1。

图2 白鲜皮在正（A）、负（B）离子模式下的总离子流图

表1 白鲜皮中主要成分的鉴定

3.2.2 白鲜皮的潜在活性成分及作用靶点

通过SwissADME 对白鲜皮主要成分进行筛选，保留GI 吸收评分和生物利用度评分高的成分，共获得4个潜在活性成分，分别为去甲基川陈皮素、黄柏酮酸、黄柏酮和柠檬苦素（图3）。

图3 白鲜皮的潜在活性成分

利用Swiss Target Prediction 数据库对白鲜皮潜在活性成分进行靶点筛选，设置Probability＞0，筛选得到作用靶点共307 个。其中，KDR、CDK5R1、CDK5、PIM1 等靶点是去甲基川陈皮素、黄柏酮酸、黄柏酮的共同靶点，推测是白鲜皮发挥药效作用的关键靶点。对各成分作用靶点分析发现，柠檬苦素作用靶点较少，但其结构与黄柏酮酸、黄柏酮相似，均为萜内酯类化合物。该类化合物具有抗炎和免疫调节作用，推测是白鲜皮治疗湿疹的主要药效物质[10]。因此，柠檬苦素可能是在空间结构上与其它两种成分存在差异，导致与靶点的结合能力不同。

3.2.3 疾病靶点与药物靶点交集venn图的构建

在GeneCards数据库中分别获取Rubella（风疹）靶点674 个、Eczema（湿疹）靶点2737 个、Damp heat sores（湿热疮毒）靶点234 个，根据Relevance score 保留大于平均值的靶点，共筛选风疹有效靶点90 个，湿疹有效靶点789 个，湿热疮毒有效靶点72 个。将白鲜皮的潜在活性成分作用靶点与疾病的主要靶点进行交集，结果见图4。

图4 药物与疾病靶点交集韦恩图

从图中可以看出，靶点TNF（肿瘤坏死因子）[11]与药物和3 种疾病均有交集，预测其为白鲜皮治疗湿疹的关键靶点。该靶点为白鲜皮中黄柏酮酸的作用靶点，推测白鲜皮在治疗湿疹等皮肤疾病时，黄柏酮酸为重要药效成分。从靶点交集中可以发现，DYRK1A为白鲜皮作用于湿疹和风疹的交集靶点，该靶点是黄柏酮的作用靶点，推测在治疗湿疹和风疹时，黄柏酮可以同时起效。白鲜皮同时作用于湿疹和湿热疮毒的交集靶点有NOS2、MPO、CASP1、MMP9，其中NOS2、MPO、MMP9是去甲基川陈皮素的作用靶点。

3.2.4 靶点蛋白互作PPI网络分析

STRING 数据库运用一种独特基于对一个常用参考数据集不同类型相关性基准打分框架，为每一个PPI 整合一个置信分数，用于评估数据的可靠性，方便对数据的取舍，推断、加权的蛋白质相互作用网络可视化，促进生物过程模块化分析，同时该数据库信息量大，具有一定的置信度的优点。将关键靶点蛋白导入STRING 数据库，进行蛋白-蛋白相互作用分析，结果见图5。图中浅蓝色和紫色线条表示已知的相互作用，绿色、红色和深蓝色线条为预测的相关作用关系。白鲜皮潜在活性成分作用靶点的PPI 网络中，共有48个节点、297条边，平均度值为12.4。

图5 靶点蛋白相互作用图

由图中可知，TNF、AKT1、MAPK1、MMP9、EGFR、MMP2、SRC、MPO 等靶点度值较大，在PPI网络中起着重要的连接作用，可能是白鲜皮治疗湿疹等皮肤病的关键作用靶点。其中TNF 靶点关联度最大，这与靶点交集处理时发现的关键靶点结果一致。TNF 是一种炎性反应介质，通过诱导前列腺素E2胶原酶的分泌以及滑膜细胞的合成，容易导致炎症反应的发生[12]，在白鲜皮治疗皮肤病时发挥着重要作用。

3.2.5 KEGG通路富集分析

通过KEGG 通路富集分析，共筛选得到14 条信号通路（P＜0.01），涉及48 个潜在靶点基因，考虑到结果假阳性率，研究过程中采用bonferroni进行了校正。取前10 条富集靶点蛋白数较多的通路，结果见表2。微生信是一个在线生物信息学数据可视化工具（http://www.bioinformatics.com.cn），将Metascape 得到的通路富集数据，按照微生信富集气泡图模块的要求处理，设置参数，X 轴为Rich factor，按P值进行排序，得到富集气泡图（图6）。

表2 白鲜皮潜在作用靶点的通路信息

图6 KEGG通路分析气泡图

通过对各信号通路分析发现，白鲜皮治疗湿疹等疾病的几个关键通路中，内分泌抗性（Endocrine resistance，ER）共 有12 个 靶 点 参 与，癌 症 途 径（Pathways in cancer,PC）共有15 个靶点参与，TNF 信号通路共有9 个靶点参与，磷脂酶D 信号通路共有8 个靶点参与，这些通路与白鲜皮抗炎、抗菌、抗肿瘤等药理活性密切相关。在这些通路当中，SRC、EGFR[13]、BCL2、TNF、MAPK[14]、HDAC、MAO 等为共同作用靶点，这也进一步说明白鲜皮通过多靶点、多通路协同发挥治疗作用。

3.2.6 白鲜皮“成分-靶点-疾病-通路”网络分析

选取KEGG 通路富集分析获得的13 条信号通路，以及对应的关键作用靶点，构建成分-靶点-疾病-通路的网络图（图7），黄色部分为与信号通路相关的关键靶点，蓝色菱形为信号通路，紫色为白鲜皮的潜在活性成分，红色矩形为疾病。在这个网络图中，可以比较全面的展示白鲜皮通过多成分、多靶点、多通路协同发挥治疗湿疹作用的主要机制。

图7 “成分-靶点-疾病-通路”网络图

通过图7可知，白鲜皮中去甲基川陈皮素、黄柏酮酸、黄柏酮等潜在活性成分，可以作用于TNF、SRC、BCL2、HDAC 等关键靶点，进而调控TNF 信号通路、Phospholipase D 信号通路、Endocrine resistance 等主要信号通路，通过调节炎症因子的表达，产生抗炎、抗菌等作用。其中，组蛋白去乙酰化酶（HDAC）是重要的染色体重构和基因表达调控因子，HDAC 抑制剂可以干扰特定的肿瘤细胞表达，有效抑制肿瘤细胞的增殖[15]。赵诗雨等[16]研究发现HDAC 抑制剂能有效抑制炎症反应，筛选具有HDAC 抑制作用的活性成分，抑制活性越强，抗炎效果越好。TNF-α 是一种促炎症细胞因子，可以提高毛细血管的通透性，导致局部缺血和血栓，从而放大炎症反应[12]。白鲜皮主要活性成分通过阻断这些促炎因子的产生，可以缓解炎症反应。抗凋亡蛋白（Bcl2）是主要存在于线粒体内质网和核膜上，负责细胞内凋亡信号的传导调控，活化之后可以抑制细胞凋亡，延长细胞的寿命[17]。SRC 是类固醇受体共激活因子，参与信号通路的调控，通过激活信号通路中的下游效应因子，可以促进癌细胞的增殖、迁移、侵袭等，对癌症细胞的产生和发展有显著影响[18]。

3.2.7 分子对接验证

选择去甲基川陈皮素、黄柏酮酸、黄柏酮和柠檬苦素等主要成分与AKT1、SRC、MMP2、EGFR 等关键靶点蛋白进行对接。通常认为结合能越小，配体与受体结合越牢固。当结合能＜-4.25 kcal·mol-1时，配体与受体有一定的结合活性，当结合能＜-5.0 kcal·mol-1，有较好的结合活性[19]。由表3 可以看出，黄柏酮和柠檬苦素与SRC、AKT1、AGTR1 和EGFR 均有一定的结合力。AGTR1 与上述4 个成分的结合力能较为牢固，推测白鲜皮成分可能主要通过作用AGTR1 受体来治疗湿疹（表3、图8）。

表3 主要成分与核心靶点基因

图8 主要成分-关键靶点分子对接

4 讨论

湿疹是临床常见的炎症性皮肤病，其发病的因素包括遗传易感性、免疫功能异常及皮肤屏障功能障碍以及环境或食物刺激等[20]。目前，对湿疹的发病机制报道的文献较少，湿疹是T 细胞所介导的迟发型变态反应，Th1/Th2 平衡紊乱是其发生主要免疫学因素，同时伴有炎性因子以及嗜酸粒细胞参与。研究表明，胸腺基质淋巴生成素（Thymic stromal lymphopoietin，TSLP）在启动Th2（辅助性T 细胞）驱动的炎症性疾病中起总开关和主调节器的作用[21]。TSLP 具体可通过两种作用途径促使机体发生免疫反应：TSLP 可启动CD4+T细胞前体向Th2炎症细胞分化，并产生Th2型细胞因子[21]，促进B细胞分泌过多的免疫球蛋白E（IgE），IgE 介导的Ⅰ型变态反应是婴幼儿湿疹的主要原因，其机制是Th2 炎性反应增强，白细胞介素（IL）4,5,13等炎性因子分泌增多，其中IL-4 可诱导B 淋巴细胞转换和IgE 合成，合成的IgE 与肥大细胞表面的IgE 受体结合，当变应原刺激导致体内特异性IgE 水平升高时，就会产生桥连结合，促进肥大细胞脱颗粒，引起Ⅰ型变态反应[22]。

白鲜皮具有祛风、清湿、解毒等功效，临床常用于风/湿疹、疮毒湿热、风湿热痹、疥癣疮癞、黄疸尿赤等症，具有多重药效药理作用[23]。目前，白鲜皮常与其他中药组成成方制剂用于治疗湿疹，对于白鲜皮提取物治疗湿疹的机制尚缺乏系统研究。白鲜皮提取物有抗瘙痒、抗过敏的作用，丛欢等[24]研究发现白鲜皮提取物抑制抗原与IgE 结合，减少肥大细胞释放组胺等炎症介质，减少机体瘙痒，具有抗瘙痒的作用。本研究采用LC-MS技术快速分析识别了白鲜皮的主要成分，共鉴定了多种化合物，最终筛选得到去甲基川陈皮素、黄柏酮酸、柠檬苦素、黄柏酮等4个潜在活性种分。通过对这些成分进行靶点筛选，其中TNF、AGTR1、AKT1、SRC、EGFR 等靶点与白鲜皮抗湿疹药理作用紧密相关。如AGTR1是血管紧张素受体家族成员之一，许晨等[25]研究发现，AGTR1 主要通过血管紧张素调节心血管系统，而血管紧张素Ⅱ（Angiotensin II）可以通过诱发内皮细胞、平滑肌细胞和免疫细胞产生轻度炎症反应，在子痫前期（PE）的发病机制中发挥重要作用。这些靶点参与调控13条信号通路，涉及TNF信号通路、内分泌抗性、癌症途径等。这说明白鲜皮在治疗皮肤病炎症反应的过程中，可以通过多成分作用于关键靶点，从而产生更好的治疗效果。网络药理学是基于药物与疾病生物分子的网络靶点机制研究，对研究药物与生物机体作用机制提供了一种新的思路[26]。“网络”是机体复杂生物系统的构建基础。“网络靶标”将病症生物分子网络当做靶标，从而为设计最佳的药物作用方式提供依据[27]。

5 结论

本文通过研究鉴定了白鲜皮中4 种活性成分，首次开展了治疗湿疹的网络药理学研究，揭示了白鲜皮治疗湿疹的主要潜在活性成分，明确了主要作用靶点和信号通路，建立了白鲜皮主要成分-靶点-通路-疾病的作用网络，并对关键成分和靶点进行分子验证，对于下一步研究白鲜皮治疗湿疹作用机理具有一定的借鉴意义。研究结果也说明中药发挥临床疗效是通过多靶点、多途径起效的，采用网络药理学方法有助于揭示中药的多靶点作用机理[28-29]。本研究参考了最新发布的《网络药理学评价方法指南》[26]，确保研究结果的准确性。通过分子对接技术，已经验证了本研究结果的正确性，在下一步研究中，我们将继续选择关键靶点和通路，进行动物实验研究，基于分子生物学方法验证白鲜皮的药效作用机理。