异绿原酸C大鼠体内代谢产物鉴定

邓志鹏，张 喆，周红燕，刘 谦，张永清，韩利文

（1. 山东中医药大学药学院 济南 250355；2. 山东第一医科大学山东省医学科学院药物研究所 济南 250062）

异绿原酸C（isochlorogenic acid C, 结构见图1）又名4,5-二咖啡酰奎宁酸，是在一分子奎宁酸的基础上引入了二个咖啡酰基结合而成的化合物，属于二咖啡酰奎宁酸类。自然界中，忍冬科的金银花、菊科的甜叶菊、苍耳、灯盏细辛等多种药用植物均含有异绿原酸类化合物，资源丰富[1]。近年来，国内外学者对异绿原酸类化合物进行了深入研究，在从植物中提取出异绿原酸成分的基础上，对其生物活性、临床价值以及应用前景进一步拓展研究，以便更好地造福人类[2-4]。研究表明，异绿原酸类化合物具有抗炎、抑菌、抗氧化、抗癌、抗病毒等药理作用，能显著抑制HBV 的复制，具有保肝和免疫调节作用，并可改善乙型肝炎病毒引起的肝脏损伤，可用于治疗肝炎[5]。临床上，异绿原酸类化合物可用于降血脂、抗动脉粥样硬化、抑制组胺释放、抗纤维化、抑制平滑肌收缩、治疗急性肺损伤，具有良好的应用前景[6-11]。此外，异绿原酸类化合物可发挥保护神经细胞、抗氧化、减轻自由基对生物膜的损伤等作用，用于脑中风等疾病治疗[12-15]。

图1 异绿原酸C化学结构

药物经口服进入机体后，经过吸收、分布、代谢、排泄等过程，被血液运输至作用部位，达到一定作用浓度后产生特征性药理作用。异绿原酸C经灌胃进入大鼠体内经过吸收、分布之后，在代谢酶作用下异绿原酸C 化学结构发生改变，即发生代谢[16]，此过程既是药物在机体最主要的消除方式，同时也是唯一导致外源性物质发生质变的过程。中药成分的代谢主要发生在肝脏，药物在肝脏部位经I 相和II 相代谢后得到易排除体外的代谢物，但也有部分药物代谢发生在肾、脾、肺、皮肤等器官[17]，以及肠内[18]。

异绿原酸C 的生物利用度很低，但是其具有显著的生物学活性，推测其活性成分可能为代谢产物[19]，经查阅文献得知代谢物可能具有药理活性、毒性或引起药物与药物间相互作用。研究表明，代谢产物的鉴定在药物发现和开发阶段具有重要指导作用[20,21]。本实验为全面了解异绿原酸C 及其体内代谢情况，采用UPLC-Q-Exactive Plus Orbitrap MS 联用技术，利用Wistar 大鼠动物体内模型，分析灌胃给药异绿原酸C后，考察血浆、尿液与粪便中的异绿原酸C的代谢产物情况，并推测体内的代谢途径，对于研究异绿原酸C作用机制具有重要参考价值，以及为研发新型药物提供数据支持。

1 材料

1.1 实验动物

健康雄性Wistar大鼠5只，体质量：200±20 g，购自济南朋悦实验动物繁殖有限公司，许可证号SCXK（鲁）2019 0003。本研究获得山东中医药大学实验动物伦理委员会批准（批准号IACUC20210407003）。

1.2 药品和试剂

对照品异绿原酸C（批号Y-070-180515，纯度≥98%）购自成都标纯化植有限公司（成都，中国）。乙腈、甲纯、甲酸均为色谱纯，水为纯净水，其余试剂为分析纯。

1.3 仪器

2.4.2 质谱条件

2 方法

2.1 药物制备

精密称取异绿原酸C 粉末适量，置于10 mL 量瓶中，加入适量0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶解，定容至刻度，配制成2.0 mg·mL-1异绿原酸C 溶液，供大鼠灌胃使用，其溶液现用现配。

2.2 样品采集

2.2.1 血浆样品的采集

将5 只雄性Wistar 大鼠作为给药组，首先适应性饲养7 天（22±2℃），于实验前禁食12 h，但自由饮水。给药组按20 mg·kg-1剂量给予异绿原酸C 溶液，分别于给药前及给药后0.5、1、2、4、8 h 于大鼠眼眶静脉丛取血，每次约0.5 mL，置于含有肝素钠的离心管中，静置15 min，然后在3000 rpm条件下离心10 min，取淡黄色上清液，于-20℃冷冻保存备用。

2.2.2 尿液样品和粪便样品的采集

雄性Wistar 大鼠5 只，适应性饲养1 周，将大鼠置于代谢笼中禁食12 h，自由饮水，收集空白尿液和空白粪便。大鼠灌胃给予异绿原酸C 后，收集0-12 h、12-24 h、24-48 h 的尿液及0-48 h 粪便。尿液合并后以3000 rpm 离心10 min，取上清液于-20℃冷冻保存备用。粪便合并后在低于50℃条件下烘干后碾碎，于离心管中在4℃保存备用。

2.3 样品处理

分别取血浆200 μL、尿液样品1 mL、粪便样品（称取粪便样品200 mg，碾碎研磨，加入1 ml甲醇，超声10 min 使其溶解，11000 rpm 离心5 min，取出上清液）1 mL，用8 倍量乙腈沉淀蛋白，在11000 rpm 离心10 min，取上清液，温和的氮气下吹干。残渣中加入0.1%甲酸水溶液-乙腈（95:5,v/v）溶液100 μL 超声溶解，离心后取样进行分析。

2.4 样品检测

2.4.1 色谱条件

父母应该引导孩子不要非常强烈地在乎细节上的对和错，因为对错往往是相对的。对于孩子做的事情，父母也不要总用对错来分析。

在小学语文的教学工作中，不仅仅只是老师与学生的事情，还是老师与老师的事情。所以在小学语文的教学以及管理上，教师之间要积极进行沟通与交流，这样可以从中获取一定的经验，而且有利于提高教师的教育能力，加强师德建设。但是在现实教学中，很多教师都忽略了师师之间相互交流的重要性，在小学语文的教学中都是各顾各的，互相不交流经验，生怕别人学去了一样。这样的现象是十分不利于师德建设工作的开展的，也在一定的程度上影响了教师的专业化发展。所以说在小学语文的教学中，教师不仅仅要注重教学质量，还要注重教师之间的交流，促进教师之间的共同进步。

3.1.3 代谢产物M2结构及代谢途径推断

Thermo Scientific 超高压液相串接Q-Exactive Plus Orbitrap 高分辨质谱（美国Thermo Fisher 公司）；EL204电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Sorvall Biofuge Stratos 高速冷冻离心机（中国赛默飞世尔科技有限公司）；WD-12氮吹仪（杭州奥盛仪器有限公司）。

离子源为电喷雾离子化源；离子源温度为320℃；电离源电压为3.3 kV；检测模式为负离子模式；扫描质量范围为m/z50-1000；鞘气为氮气（纯度＞99.99%），流速为45 Arb；辅助气为氮气（纯度＞99.99%），流速为10 Arb。

2.5 数据采集与处理

血浆、尿液及粪便样品预处理后，利用UPLC-QExactive Plus Orbitrap 高分辨质谱采集数据，并将数据导入Thermo Xcalibur Qual Browser 软件，对数据进行色谱峰提取、质谱碎片离子峰匹配分析。

校企共同成立教学质量监控管理机构，负责教学质量保障体系的组织运行与实施、信息整理与反馈。依托网络教学综合服务平台，建立持续改进的质量保障体系，深入推进教学模式、教学考核评价和资源体系改革，全面落实以学生为中心的个性化培养体系，真正实现“以学为主”的教学模式转变。建立学业动态预警机制，让学生能够及时正视自身问题，分析并进行改正。通过毕业生就业发展跟踪、用人单位反馈和第三方教育评估机构的人才培养质量年度报告，评估学生的职业能力与素质并及时反馈，确保人才培养质量的全面提高。

3 结果与分析

本实验利用UPLC-Q-Exactive Plus Orbitrap-MS/MS 联用技术分析生物样品，基于不同基质样品在负离子模式下的总离子流色谱图和二级质谱提供的分子离子和碎片离子等精确信息（图2-图3），鉴定异绿原酸C在大鼠血浆、尿液、粪便中的代谢产物。根据原型化合物的裂解规律、相对保留时间、质谱数据以及结合文献来推测代谢产物结构，在血浆、尿液、粪便中共检测到包括原型在内的11 个成分，其中粪便（F）中发现原型（M0）外，还有4个代谢物（M1-M4）；尿液（U）中发现6 个代谢物（M5-M10）；在血浆中未发现代谢物，详细信息见表1。其代谢途径包括有水解、氧化、还原、甲基化、葡萄糖醛酸化、硫酸酯化。

在负离子模式下，检测到M0 准分子离子峰m/z515.121 0([M-H]-，C25H23O12)，其相对保留时间为19.66 min。分子离子碎裂，产生m/z353.088 5 (C16H17O9)、191.055 7 (C7H11O6)、179. 034 6 (caffeoyl，C9H7O4)、173.054 0(C7H9O5)、135.044 2(C8H7O2)碎片离子。其中m/z353.088 5 是异绿原酸C 脱去1 分子咖啡酰基得到的碎片，m/z191.056 1 是异绿原酸C 脱去两分子咖啡酰形成的奎宁酸负离子碎片，m/z179.034 6 是咖啡酰基的特征碎片，碎片离子m/z135.045 5 是咖啡酰基失去1 分子CO2所得。综合保留时间以及二级质谱的碎片离子信息，确定化合物M0为异绿原酸C。

表1 异绿原酸C在大鼠粪便和尿液中的代谢产物汇总信息

图2 空白和给药大鼠粪便样品在负离子模式下的色谱图

图3 空白和给药大鼠尿液样品在负离子模式下的色谱图

3.1 大鼠粪便中的代谢产物

3.1.1 原型药物M0质谱裂解途径推断

在21世纪的互联网和人工智能新时代中，有关领导力的出版物不少，而《论领导力》一书是领导力学术界的一朵奇葩，读此书的人对其评价是“喜欢其中的思想和醍醐灌顶的金句”。

“咬碎了牙齿怎么了呢？咬碎了牙齿和血吐。——老家就有这句话。”她说，“不管怎么说，我总算是凭自己的力量在风城买了房子啊。”

3.1.2 代谢产物M1结构及代谢途径推断

在负离子模式下，代谢产物M1 的tR为6.59 min，[M-H]-为m/z221.067 5（C8H13O7），产生m/z203.106 5、159.044 6、141.000 7、137.096 7 碎片离子。其中离子m/z221.067 5比奎宁酸（m/z191.056 1）多30 Da，推测其为C7H11O6+O+CH2，而二级碎片离子m/z203. 106 5比m/z221.067 5 少18 Da ,推测其为m/z221.067 5 失去1 分子H2O 产生的裂片。推测M1 代谢途径为水解反应、单氧化反应、甲基化反应。

Thermo C18色谱柱（2.1 mm×100 mm, 1.9 μm）；流动相为乙腈（A）和0.1%甲酸水溶液（B）；梯度洗脱（0-2 min，3% A；2-24 min，3%→25% A；24-25 min，25%→95% A；25-27 min，95% A；27-27.1 min，95%→3%A；27.1-30 min，3% A）。进样室温度设置为10℃；柱温为40℃；流速为0.4 mL·min-1；进样体积为5 μL。

在负离子模式下，代谢产物M7 的tR为7.39 min，[M-H]-为m/z355.104 7（C16H19O9），得到m/z179.070 9、113.023 6 的碎片离子。其中m/z355.104 7 为异绿原酸C 脱去一个咖啡酰基并发生氢化还原反应的信号，m/z179.070 9 是咖啡酰基在负离子模式的特征信号，推测M7的代谢途径为水解反应、氢化反应。

3.1.4 代谢产物M3结构及代谢途径推断

除了不喜欢人们泼水、扔石子，以及用竿子捅戳以外，明尼对人类并没有真正的恶感。但此刻它的眼中满是寒光，满腔冰冷的恨意全集中在了眼前这个男人身上。这是从古老湿地的深处挖掘出来的、久被遗忘的来自爬行动物的恨意，这股恨意汇聚成了锋利的目光。将渔线紧拉在船舷上的男人感受到了这道目光古怪的力量，心里有点发毛。这双充满敌意的眼睛正一眨不眨地死死地盯着他！

在负离子模式下，代谢产物M3 的tR为11.30 min，[M-H]-为m/z367.101 7（C17H19O9），产生m/z193.0502、178.062 3、134.063 6 碎片离子。其中m/z367.101 7 比m/z353.087 8 多14 Da，推测其为m/z353.087 8 发生甲基化反应产生的信号，m/z193.050 2 为咖啡酰甲基化产生的信号（C10H9O4），推测M3为异绿原酸C水解脱去一个咖啡酰基同时发生甲基化反应的产物，其代谢途径为水解反应、甲基化反应。

3.1.5 代谢产物M4结构及代谢途径推断

体验式教学法，是指在教学过程中为了达到既定的教学目的，从教学需要出发，引入、创造或创设与教学内容相适应的具体情境或氛围，以引起学生的情感体验，帮助学生迅速而正确地理解教学内容，促进他们心理机能全面和谐发展的一种教学方法。体验式教学法使学生身临其境或如临其境，一则带给学生从形象的感知到抽象的理性的顿悟，二则激发学生的学习兴趣和学习情绪，使学习活动成为自主自发的活动。同时，在教学实践中，体验式教学法在英语阅读课、写作课研究相对较多，而将其运用到语法课研究的则比较少。[1]

五要着力搞好协调配合。水利财务工作涉及水利各个领域，贯穿各个环节，必须加强协调，形成合力。要建立与各有关部门的沟通协调机制，形成相互理解、相互支持的工作氛围，争取更多有利于水利改革发展的政策措施。要加强内部上下级之间和部门之间的沟通配合，建立工作信息通报和反馈机制，密切配合，良性互动，切实提高工作水平。

在负离子模式下，代谢产物M4 的tR为14.78 min，[M-H]-为m/z367.104 6（C17H19O7），产生m/z193.050 3、173.044 9、93.033 5 碎片离子。其中m/z367.104 6 为m/z353.087 8 发生甲基化反应产生的信号，m/z193.050 3 为咖啡酰甲基化产生的信号（C10H9O4）；m/z173.044 9 为m/z191.056 1（C7H11O6）脱去一分子H2O 产生的信号，推测M4为异绿原酸C水解脱去一个咖啡酰基同时发生甲基化反应的产物，其代谢途径为水解反应、甲基化反应。

水利工程的建设，积极推进全面质量管理，采用先进的质量管理模式和管理手段，科学技术和先进的施工技术的推广，利用科学的方法和科技的力量降低工程的材料成本，提高工程质量。施工企业要实施全面质量管理，建立健全质量保证体系，制定和完善岗位质量标准、质量责任和考核办法，实施质量责任制。在施工过程中加强质量检查工作，认真落实“三项制度”，全过程的控制，对项目的质量，关系到企业的前途和命运，是水利水电施工企业基于国内外市场抓住关键。

3.2 大鼠尿液中的代谢产物

3.2.1 代谢产物M5结构及代谢途径推断

在负离子模式下，代谢产物M5 的tR为8.47 min，[M-H]-为m/z237.061 9（C8H13O8），产生m/z195.113 7、165.057 6（C9H10O3）、149.096 5、121.048 2 的碎片离子，推测M5 的代谢途径为水解反应、双氧化反应、甲基化反应。

3.2.2 代谢产物M6结构及代谢途径推断

胶原蛋白是动物体内含量最丰富的蛋白质，占人体皮肤蛋白质的70%。在真皮层中，胶原蛋白与其他物质形成网状结构，有助于皮肤稳定结构、强度、弹性。目前关于口服胶原蛋白肽改善皮肤的研究很多，结果发现口服胶原蛋白肽具有改善皮肤状况、减少皱纹、提高皮肤水分、修复光损伤皮肤、延缓衰老等功能[2]。其机理主要是摄入胶原蛋白肽后，能够提高皮肤中胶原蛋白表达，降低基质金属蛋白酶2的活性[3]，以特异性蛋白的方式影响成纤维细胞的增殖和胶原纤维的形成[4]。

在负离子模式下，代谢产物M6 的tR为6.26 min，[M-H]-为m/z271.011 6（C7H11O9S），产生m/z191.054 2、161.034 7、96.958 9的碎片离子。其中m/z191.054 2（C7H11O6）为m/z271.011 1脱去一分子SO3，即奎宁酸的特征信号；m/z161.034 7为咖啡酰基的特征碎片，即咖啡酸（C9H7O4）脱去一分子H2O 产生的信号，推测M6 的代谢途径为水解反应、硫酸酯化反应。

3.2.3 代谢产物M7结构及代谢途径推断

在负离子模式下，代谢产物M2 的tR为3.60 min，[M-H]-为m/z237.060 8（C8H13O8），产生m/z193.069 6、137.043 5 的碎片离子。其中离子m/z237.060 8 比奎宁酸（m/z191. 056 1）多46 Da，推测其为C7H11O6+2O+CH2，推测M2 的代谢途径为水解反应、双氧化反应、甲基化反应。

3.2.4 代谢产物M8结构及代谢途径推断

在负离子模式下，代谢产物M8 的tR为13.81 min，[M-H]-为m/z355.103 1（C16H19O9），产生m/z179.070 9、113.023 6 的碎片离子。其中m/z355.103 1 为异绿原酸C 酸脱去一个咖啡酰基并发生氢化还原反应的信号，m/z179.070 9（C9H7O4）是咖啡酰基在负离子模式的特征信号，推测M8 的代谢途径为水解反应、氢化反应。

(3)净化过滤机。本项目通过消化、吸收、再创新，解决了通常管式过滤器钢衬胶骨架橡胶层弹性收缩易开裂等腐蚀问题，使得骨架寿命由半年左右延长至5年多，管式过滤器运行状况良好，综合性能指标大幅提升。其他类型过滤机各项技术指标良好，运行正常。

3.2.5 代谢产物M9结构及代谢途径推断

（1）假设数据集的维数为d，SU={u1，u2，…，u2d}为没有邻近稠密网格的稀疏网格单元，计算各网格的重心点坐标 gi|i=1，2，…，2d；

在负离子模式下，代谢产物M9 的tR为3.87 min，[M-H]-为m/z435.061 6（C16H19O12S），产生m/z355.105 7、191.055 3、173.045 3、113.023 4、96.956 0 碎片离子。其中m/z435.061 6 为m/z353.087 8+2H+SO3产生的信号，m/z355.105 7 为m/z435.061 6 脱去一分子SO3产生的信号，m/z191.055 3（C7H11O6）是奎宁酸在负离子模式的特征信号，m/z173.045 3 为奎宁酸脱去一分子H2O 产生的信号，推测M9 的代谢途径为水解反应、氢化反应、硫酸酯化反应。

3.2.6 代谢产物M10结构及代谢途径推断

在负离子模式下，代谢产物M10 的tR为7.75 min，[M-H]-为m/z529.120 4（C22H25O15），产生m/z353.088 6、179.034 7、135.043 8 碎片离子。其中m/z529.120 4 为m/z353.088 6 与一分子葡萄糖醛酸结合产生的信号，m/z353.088 6（C16H17O9）为异绿原酸C 脱去一个咖啡酰基产生的信号，m/z179.034 7（C9H7O4）是咖啡酰基在负离子模式的特征信号，m/z135.043 8 为咖啡酰基脱去一分子CO2产生的信号，推测M10 为异绿原酸C 水解脱去一个咖啡酰基并与葡萄糖醛酸结合生成的产物，其代谢途径为水解反应、葡萄糖醛酸化反应。

3.3 异绿原酸C大鼠体内的代谢途径分析

异绿原酸C经灌胃给药后在大鼠体内的代谢途径主要有水解、甲基化、氧化、还原、葡萄糖醛酸化、硫酸酯化等（图4）。异绿原酸C（C25H24O12，m/z515.121 0）进入大鼠体内后，首先水解脱去一个咖啡酰基形成单咖啡酰基奎宁酸（m/z353.087 8，C16H18O9），该中间体可以发生甲基化反应形成代谢产物M3 和M4（m/z367.101 7,C17H19O9）、氢化还原形成代谢产物M7 和M8（m/z355.103 5,C16H20O9）、氢化和硫酸酯化反应形成代谢产物M9（m/z435.061 6, C16H19O12S）、葡萄糖醛酸化反应生成代谢产物M10（m/z529.120 4,C22H25O15）。此外，异绿原酸C 进入大鼠体内后也可水解脱去二个咖啡酰基形成奎宁酸中间体（m/z191.055 7,C7H11O6），该中间体可以发生单氧化和甲基化反应形成代谢产物M1（m/z221.067 5,C8H13O7）、双氧化和甲基化反应形成代谢产物M2 和M5（m/z237.060 8,C8H13O8）、硫酸酯化反应形成代谢产物M6（m/z271.011 6,C7H11O9S）。

图4 异绿原酸C大鼠体内代谢途径推测

4 讨论与结论

生物样品组成比较复杂，尤其蛋白质会严重影响分离效果以及待测物的离子化效率。因此生物样品的预处理在样品分析过程中极为重要[22-23]。测定血浆样品前，需去除蛋白质，预防发生乳化，影响质谱仪器的信号响应，延长其使用寿命。LC-MS 技术兼具有色谱和波谱两者优势，分离度好、适用范围广、灵敏度高、分析时间短，可从大量混合物中分离出单一成分进而获得单一成分的质谱信息，且样品不需要进行衍生化处理，依靠高分辨质谱给出的一级和二级质谱的精确数据，推断化合物结构。高分辨率质谱具有分离度好、灵敏度高、检测范围宽的特点，液质联用技术在药物代谢产物鉴定应用方面发挥了重大作用[24-26]。

本实验采用UPLC-Q-Exactive Plus Orbitrap MS 技术检测异绿原酸C 在大鼠血浆、粪便、尿液中的代谢物，然后利用Thermo Xcalibur Qual Browser 软件分析色谱峰，确证代谢产物。大鼠经灌胃给药后，异绿原酸C经小肠吸收入血后随血液循环分布到机体的各个器官发挥治疗作用。此外，药物的首过效应、溶解性、溶出度及生理因素等也会影响药物在体内的吸收[27]。中药体内代谢产物的结构鉴定是中药代谢研究的基础部分，不仅能为临床安全用药提供参考，还可用于指导药物结构修饰，为新的药物分子设计提供理论依据。

根据异绿原酸C 具有多个酚羟基、酯键和羧基的结构特点和詹美榕等[19]研究实验结果得到的代谢产物表明异绿原酸C 在体内能发生酯键水解、有甲基化反应、水合反应、去水合反应、还原反应、葡萄糖醛酸化反应、硫酸酯化反应等。詹美榕等研究在大鼠血浆中发现多个代谢产物，但在本实验测定中未发现血浆代谢产物，究其原因我们实验选择单次给药（给药剂量20 mg·kg-1），而文献报道[19]采用连续7 天灌胃给予药物（给药剂量20 mg·kg-1，每天1 次），连续给药也许导致大鼠体内代谢酶发生改变，并且会产生代谢产物的富集从而导致血浆中代谢产物的不同。本实验开展大鼠血浆、尿液、粪便代谢产物的鉴定，可以更全面地了解不同生物基质中异绿原酸C 的可能代谢产物，后期还可以采用大鼠胆管插管模型（BDC）进行研究，探讨其胆汁排泄产物。