黑小麦粉的抗氧化成分及活性

牛新奎，韩小贤，郑学玲

（河南工业大学粮油食品学院，河南郑州 450001）

黑小麦是指种子的颜色较深，呈蓝、紫、紫黑、黑等颜色小麦的统称，由黑麦和普通小麦杂交形成的小麦品种，原产于欧洲，主要呈现黑色、紫色或者黑紫色，目前我国也是黑小麦的主要种植区[1]。相比于普通小麦，黑小麦中富含膳食纤维，据美国农业部国家营养数据库数据显示[2]，黑小麦中膳食纤维的含量达14.6%，比普通小麦高10%。同时黑小麦是一种天然的黑色食品，营养价值极高，不仅蛋白质含量高，而且富含多种生物活性成分，包括戊聚糖、阿魏酸、花色苷、多酚、黄酮等[3,4]。这些生物活性成分性质稳定，其中花色苷、多酚、黄酮更是天然的抗氧化物质，能够有效地清除体内自由基，提高人体免疫力，降血压，预防癌症[5-7]。黑小麦其独特的营养功能特性，符合未来食品发展的趋势，近年来，黑小麦在食品工业中的应用越来越广，其研究价值越来越高。目前黑小麦已经广泛用于制作面包、馒头、营养冲剂等产品[8,9]。随着食品科学技术的不断创新和飞速发展，黑小麦将会朝着食品类型多样化、方便化和营养化的方向不断发展。同时，黑小麦现在已经不仅仅作为食品食用，黑小麦在药品，化妆品，染色剂等领域内的应用也越来越广泛[10,11]，黑小麦作为一种天然健康的优质原料，将会逐渐应用到各行各业中。

中国的黑小麦种类繁多，但产量比较低，因此目前对黑小麦的研究最主要集中在育种和栽培方面，产后加工和利用方面的系统研究相对较少。本研究选取两种新培育且具有代表性的黑小麦16W16（紫色小麦）和运黑14207（蓝麦）作为研究对象，以普通中筋优质小麦永良4号为对照，对黑小麦全麦粉、面粉和麸皮的主要活性成分（多酚、黄酮和花色苷）的含量和抗氧化活性进行研究，以期为黑小麦全麦粉、面粉和麸皮的加工利用提供理论依据。

1 材料与设备

1.1 材料与试剂

供试黑小麦2种（16W16、运黑14207），由山西省农业科学院提供；普通中筋对照小麦（永良4号）由内蒙古恒丰食品工业股份有限公司提供。

化学试剂均采用分析纯。

1.2 仪器与设备

JFXM110锤式旋风磨，杭州其伟光电科技有限公司；LXJ-IIB型低速大容量离心机，上海安亭科学仪器厂；pHS-3C pH计，上海仪电科学仪器；UV762紫外分光光度计，上海仪电分析有限公司；SHZ-B型水浴振荡器，上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；SCQ-超声清洗器，上海声彦超声仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 黑小麦制粉

全麦粉由旋风磨对整粒小麦直接研磨粉碎过筛得到。面粉和麸皮均由小麦籽粒润麦24 h调节水分含量至16%，然后采用MLU-202型布勒实验磨磨粉后制得，其中16W16，运黑14207和永良4号的出粉率分别是67%、68%和69%，符合实验室正常制粉出粉率，16W16、运黑14207和永良4号粗麸得率分别是19%、13%和16%，细麸得率分别是14%、19%和15%。

1.3.2 黑小麦提取液的制备

选用体积分数60%乙醇作为提取溶剂，通过超声辅助来对活性成分进行提取。准确称取黑小麦粉1.0 g于50 mL的离心管中，加入体积分数60%乙醇溶液25 mL，混匀后在40 ℃下，设置超声功率300 W进行超声处理1 h，然后将浸提液在离心机以5 000 r/min的速度离心20 min，上清液即为黑小麦粉提取液。

1.3.3 总酚含量测定

参照向莉[12]采用Folin-Ciocalteu法测定总酚含量：吸取提取液0.5 mL，加入福林酚试剂0.75 mL，再加入质量分数10%的Na2CO3试剂1.5 mL，定容至10 mL，在35 ℃水浴中反应30 min，在765 nm处测定吸光度，60%乙醇溶液代替提取液为空白对照。以不同浓度的没食子酸标准品（μg/mL）为X轴，吸光度A为Y轴制图，得到线性回归方程：

根据标准曲线及样品吸光度，计算黑小麦的总黄酮含量，结果表示为：（mg GAE/g）（GAE：Gallic Acide Equivalent，没食子酸当量）。

1.3.4 黄酮含量测定

参照李帑洛[13]采用NaNO2-Al(NO3)3比色法测定黄酮含量：吸取提取液1.0 mL，加入质量分数5%的NaNO2溶液1.0 mL，静置反应6 min；再加入质量分数10%的Al(NO3)3溶液1.0 mL，静置反应6 min；最后加入质量分数4%的NaOH溶液4 mL，定容至10 mL，静置反应15 min，在510 nm处测定吸光度，60%乙醇溶液代替提取液为空白对照。以不同浓度的芦丁标准品（mg/mL）为X轴，吸光度A为Y轴制图，得到线性回归回归方程：

根据标准曲线及样品吸光度，计算黑小麦的总黄酮含量，结果表示为：（mg RE/g）（RE：Rutin Equivalent，芦丁当量）。

1.3.5 花色苷含量测定

参照耿然[14]采用pH示差法并稍作修改：取2支离心管，分别吸取提取液2.0 mL，在两只离心管中分别加入KCl-HCl的缓冲液（pH值1.0）和CH3COONa缓冲液（pH值4.5）8.0 mL，然后以5 000 r/min的转速离心20 min，使杂质沉淀，以体积分数60%的乙醇溶液代替提取液做空白对照，测量530 nm波长下测定吸光度A1.0和A4.5，花色苷含量公式如下：

式中：

C——花色苷含量，表示1 kg黑小麦粉中花色苷含量，mg/kg；

A1.0——pH值1.0时花色苷的吸光度；

A4.5——pH值4.5时花色苷的吸光度；

V——提取液的总体积，mL；

n——稀释倍数（5）；

M——矢车菊-3-葡萄糖苷（Cy-3-Glu）相对分子量（449）；

ε——Cy-3-Glu的消光系数（29600）；

m——样品质量，g。

1.3.6 抗氧化性测定

1.3.6.1 铁离子还原能力的测定

参考Gonalves[15]的方法并做出调整：量取提取液0.5 mL于试管中，加入0.2 mol/L PB缓冲液2.5 mL，加入1%铁氰化钾溶液（m/V）2.5 mL，混匀，于50 ℃水浴中反应20 min，之后加入10%的三氯乙酸（TCA，m/V）2.5 mL终止反应。离心后取上清液2.5 mL，加入蒸馏水1.0 mL，0.1%的三氯化铁溶液（m/V）0.5 mL，于700 nm下测定其吸光度，60%乙醇溶液代替提取液为空白对照。以不同浓度的Trolox溶液（mg/mL）为X轴，吸光度A为Y轴制图，得到线性回归回归方程：

根据标准曲线及样品吸光度，结果表示为还原每克样品的所需的Trolox质量：（mg TE/g）（TE：Trolox Eqequivalent，水溶性维生素E当量）。

1.3.6.2 DPPH自由基清除率的测定

参考Hu等[16]的检测方法进行测定：取3支离心管，向离心管中依次加入提取液、体积分数60%乙醇和0.25 mmol/L DPPH溶液，在37 ℃下避光反应30 min，5 000 r/min的速度离心10 min，将上清液在510 nm处测定吸光值，通过公式（5）计算DPPH自由基清除率K1。

式中：

K1——DPPH自由基清除率，%；

A0——（4 mL 60%乙醇+4 mL DPPH溶液）吸光度值；

A1——（1 mL提取液+3 mL 60%乙醇+4 mL DPPH溶液）吸光度值；

A2——（1 mL提取液+3 mL 60%乙醇+4 mL无水乙醇）吸光度值。

1.3.6.3 ·OH清除率的测定

参考王盼等[17]的检测方法基础稍作修改进行测定：取三支离心管，向离心管中依次加入9 mmol/L的FeSO4溶液、提取液、H2O2溶液，混匀后室温下静置10 min，再加入9 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液，混匀后在25 ℃下水浴反应30 min，以蒸馏水做空白对照，在510 nm出测定吸光值，通过公式（6）计算·OH清除率K2：

式中：

K2——·OH自由基清除率，%；

A0——（2.0 mL FeSO4+2.0 mL 60%乙醇+2.0 mL H2O2+2.0 mL水杨酸-乙醇）吸光度值；

A1——（2.0 mL FeSO4+2.0 mL提取液+2.0 mLH2O2+2.0 mL水杨酸-乙醇）吸光度值；

A2——（2.0 mL FeSO4+2.0 mL提取液+2.0 mL H2O2+2.0 mL无水乙醇）吸光度值。

1.4 数据处理

试验数据以3次平行实验的平均值±标准差表示，使用Excel 2010、Origin 2017和SPSS 25.0软件对试验数据进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 黑小麦多酚含量分析

多酚具有极强的抗氧化能力，能够有效地保护体内生物大分子免受氧化损伤[18]。图1为黑小麦全麦粉、麸皮和面粉中多酚的含量。由图1可知，在全麦粉中，黑小麦16W16中多酚含量为3.73 mg/g，比对照小麦永良4号高出23%；运黑14207全麦粉中多酚含量是3.16 mg/g，比对照小麦高出4%。多酚在三种小麦的制粉产物中，含量由高到低依次为粗麸、细麸和面粉。16W16、运黑14207和永良4号中粗麸中多酚含量分别为为6.67、5.35和4.28 mg/g，根据面粉和麸皮所占比例及多酚总含量计算，分别占多酚总含量的30.09%、28.29%和25.03%；16W16、运黑14207和永良4号面粉中多酚含量分别是3.01、3.02和2.86 mg/g，分别占多酚总含量50.28%、56.36%和58.86%，均高于50%。实验结果表明，在此实验中，黑小麦中多酚含量显著高于对照小麦，多酚在面粉中含量显著低于麸皮和全麦粉，但面粉中多酚含量占总多酚含量的50%以上，即多酚主要存在于面粉中。

图1 黑小麦粉中多酚含量Fig.1 The polyphenol content in Triticum aestivum flour

2.2 黑小麦黄酮含量分析

图2 黑小麦粉中黄酮含量Fig.2 The flavone content in Triticum aestivum flour

黄酮类化合物是大自然中的一大类化合物的统称，由于黄酮分子结构中含有大量酚羟基，小麦胚芽黄酮类化合物具有抗氧化活性，能抑制多种化学物质诱变，具有提高机体的免疫等功能[19]。图2是黑小麦粉全麦粉和制粉产物各组分中黄酮的含量。由图2可知，16W16黑小麦全粉的黄酮含量为2.45 mg/g，是永良4号（1.33 mg/mL）黄酮含量的1.84倍；运黑14207的黄酮含量是1.58 mg/g，比永良4号高19%。根据面粉、粗麸和细麸所占比例及黄酮含量计算，和永良4号类似，16W16和运黑14207中粗麸、细麸和面粉中黄酮的含量分别占总黄酮含量的57%、23%和20%左右。实验结果表明：黑小麦麸皮和全麦粉中，黄酮含量显著高于普通小麦（p＜0.05）；与多酚不同，并且麸皮中的黄酮含量占总黄酮含量的80%左右，即黄酮主要存在于黑小麦的麸皮中。

2.3 黑小麦花色苷含量分析

花色苷是一种天然的医药保健活性物质成分，由于其具有良好的抗氧化、降血脂、抑制肿瘤的作用，在医疗和保健品上具有十分广泛的应用[20]。图3是黑小麦全麦粉和制粉产物各组分中花色苷的含量，由图3可知，16W16和运黑14207黑小麦全粉中的花色苷含量是111.33 mg/kg和74.73 mg/kg，分别是对照小麦永良4号全粉中花色苷含量的19.1倍和7.3倍。与全麦粉不同，16W16面粉中花色苷含量低于运黑14207，16W16和运黑14207面粉中花色苷含量分别为1.58 mg/kg和8.15 mg/kg。根据面粉和麸皮所占比例及花色苷含量可得各组分花色苷占总花色苷比例，16W16粗麸中花色苷含量是672.31 mg/kg，占总花色苷含量的79%，细麸中花色苷含量是234.61 mg/kg，占花色苷总量的20.33%，面粉占花色苷含量仅占花色苷总含量的0.64%。根据运黑14207的测试结果发现，运黑14207粗麸中花色苷含量是124.60 mg/kg，占总花色苷含量的69.79%，细麸中花色苷含量是74.73 mg/kg，占总花色苷含量的28.84%，面粉中的花色苷含量仅占总花色苷含量的1.38%。结果表明，黑小麦中的花色苷显著高于普通小麦（p＜0.05），并且黑小麦中花色苷在于黑小麦麸皮中含量大约为总含量的99%，即花色苷主要存在黑小麦的种皮结构中。

图3 黑小麦粉中花色苷含量Fig.3 The anthocyanin content in Triticum aestivum flour

综合分析，16W16和运黑14207中的抗氧化活性成分均显著高于普通对照小麦永良4号（p＜0.05），黑小麦中的花色苷、多酚和黄酮在粗麸中含量最高，说明其主要存在于黑小麦的种皮结构。

2.4 黑小麦的抗氧化活性分析

2.4.1 铁离子还原能力分析

铁离子还原能力的主要是基于氧化还原反应，在反应过程中，提取液中的活性成分将Fe3+还原成为Fe2+，其还原能力用每克干物质黑小麦粉消耗的Trolox当量（TE）表示，每克干黑小麦粉消耗的TE越高，表明黑小麦粉的抗氧化能力越强，根据吸光度的变化测定其抗氧化能力的强弱。图4为黑小麦粉提取液铁离子抗氧化能力的测定，由图4可知，16W16和运黑14207全麦粉的铁离子还原能力为2.34和1.54 mg TE/g，分别高出对照小麦粉铁离子还原能力的125%倍和48%。在黑小麦粉的各制粉产物中，黑小麦粉粗麸的抗氧化能力最强，16W16粗麸粉的抗氧化能力为5.73 mg TE/g，是16W16全麦粉抗氧化能力的2.45倍。

图4 黑小麦粉铁离子还原能力测定Fig.4 Determination of iron ion reduction ability of Triticum aestivum flour

2.4.2 DPPH自由基清除率分析

图5 黑小麦粉对DPPH自由基清除率测定Fig.5 Determination of DPPH radical scavenging rate of Triticum aestivum flour

1-二苯基-2-三硝基苯肼简称DPPH，DPPH是一种稳定的有机自由基，被广泛应用与测定天然产物的抗氧化能力。一般情况下，对DPPH自由基清除率越强，其抗氧化能力越强。图5为黑小麦粉提取液对DPPH自由基清除率测定结果。由图5可知，测定结果与铁离子还原能力测定结果类似，16W16和运黑14207全麦粉提取液对DPPH自由基清除率分别是48.18%和24.05%，均显著高于对照小麦永良4号（p＜0.05）。16W16粗麸、细麸和面粉自由基清除率分别是97.00%、75.28%和14.08%，运黑14207粗麸、细麸和面粉对DPPH自由基清除率分别是67.95%、54.81%和8.09%，即黑小麦粉的抗氧化能力由大到小依次为粗麸粉＞细麸粉＞全麦粉＞面粉，说明黑小麦中麸皮的抗氧化活性更强。

2.4.3 OH自由基清除率分析

图6为黑小麦粉对·OH清除率的结果，测定的结果与铁离子还原能力和DPPH自由基清除率略有不同，运黑14207粗麸、细麸、全麦粉和面粉对·OH的清除率分别是79.91%、44.92%、36.02%和22.97%，与对照小麦永良4号无显著性差异（p＞0.05）。16W16粗麸、细麸和全麦粉对·OH的清除率分别是88.30%、70.16%和42.46%，均显著高于对照小麦永良4号（p＜0.05）。即黑小麦运黑14207对·OH清除率与普通对照小麦无显著性差异，黑小麦16W16对·OH清除率最高，即黑小麦16W16的抗氧化活性更强。

图6 黑小麦粉对·OH清除率的测定Fig.6 Determination of ·OH scavenging rate of Triticum aestivum flour

本实验通过三种方式对黑小麦各组分的抗氧化活性进行测定。综合分析，两种黑小麦全麦粉的抗氧化能力高于对照小麦永良4号，其中16W16的抗氧化活性最强；通过比较两种黑小麦的麸皮和面粉进行抗氧化活性测定发现，粗麸粉的抗氧化活性更强，其中黑小麦16W16粗麸粉的抗氧化活性最强。

3 结果

试验通过对黑小麦各组分中生物活性物质及抗氧化性的研究发现：黑小麦中的花色苷，多酚和黄酮含量均显著高于所选的普通小麦（p＜0.05），黑小麦各组分的抗氧化能力高于所选的普通对照小麦（p＜0.05）。黑小麦麸皮中的花色苷和黄酮分别占总质量的99%和80%左右，即黑小麦中的花色苷、多酚和黄酮主要存在于黑小麦麸皮中，即黑小麦的种皮部位。通过布勒磨加工后得到的产物中，16W16粗麸粉中抗氧化成分含量最高，其多酚、黄酮和花色苷的含量分别为6.67 mg GAE/g、8.42 RE/g和672.31 mg/kg；16W16粗麸粉的抗氧化能力最强，其铁离子还原能力为5.73 mg TE/g，对DPPH·和·OH的清除率分别是97.00%和88.30%。综合分析，在全麦粉中，黑小麦16W16抗氧成分含量最高，16W16粗麸粉抗活性能力最强；在制粉产物中，粗麸粉抗氧成分含量最高，16W16粗麸粉抗活性能力最强。总之，黑小麦16W16可以作为一种很好的黑色食品的来源。

随着社会的不断发展，黑小麦由于其特殊的营养保健价值备受关注，本实验对黑小麦的抗氧化性进行研究。黑小麦面粉多酚含量显著高于对照小麦，可以用于面条、馒头等主食的制作；但是由于黑小麦面粉中抗氧化成分含量与对照面粉的差异比较小，因此黑小麦在食品中一般保留全麦粉使用。相信随着黑小麦产业体系的不断发展，黑小麦将会通过其他加工手段或与其他食品进行复合，从而改善其口感，并且最大限度地降低其营养成分在加工过程中造成的不必要流失，通过对其营养价值的开发，不断改善人们的饮食结构，更加科学合理地供人们食用。