虎掌菌的酶解工艺优化及酶解前后风味成分的对比分析

王秋婷，李泽林，桂海佳，谷大海，王雪峰，肖智超，王桂瑛，普岳红，范江平

（云南农业大学食品科学技术学院，云南昆明 650201）

虎掌菌又叫枣翘鳞肉齿菌[Sarcodon imbricatus(L.) P. Karst.]，是担子菌纲多孔菌科多孔菌属的一类真菌，因菌盖有块状鳞片，形状尤像虎爪而得名，呈黑褐色，主要分布在我国甘肃、西藏、四川和云南等地[1,2]。中医认为虎掌菌性平味甘、温热，食用后可抗寒气、活络胫骨、转阳补肾之功效，还可对关节炎、腰背酸痛和风湿等有明显预防和缓解作用[3]。现有研究表明，虎掌菌的胞外多糖，可以辅助治疗癌症、肿瘤和肝硬化等疾病，并且具有增强人体免疫细胞活性，提高人体自身免疫力的作用，此外还可以用于夏季驱蚊和防止米面生虫[4]。

除了优良的药用价值外，虎掌菌菌肉味道鲜香浓脆，具有较高的食用、经济价值，而且其丰富的矿质元素、高蛋白含量、低脂肪以及含有多种人体必需氨基酸与非必需氨基酸比例适宜，并含有一定浓度的呈味氨基酸[5]。王婷婷等[6]研究了云南黑虎掌菌的挥发性成分，发现醛类、烃类、醇类、酮类化合物对其风味具有重要贡献。Alasalvar等[7]研究了人工养殖与野生虎掌菌在冷藏过程中挥发性化合物变化有差异。然而，在加工过程中如：蛋白质、氨基酸、风味前提物和多糖等难以被充分分解和反应，导致风味和活性物质释放不彻底，口感不及预期，使得经济效益达不到应有的价值，所以在加工前增加酶解工艺促进风味相关物质分解释放或者进行其他相关促进风味的预处理可以很大程度上解决以上问题。但是，目前还尚未见到酶解虎掌菌以及酶解前后风味差异的研究报道，对其深入研究可增加虎掌菌风味释放的方案，促进虎掌菌产业的发展。

因此，拟选取木瓜蛋白酶和风味蛋白酶两种被验证可以释放风味的蛋白酶酶解虎掌菌，并在单因素的基础上，采用响应面设计优化虎掌菌双酶解工艺，使用氨基酸自动分析仪与顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（HS-SPME-GC-MS）结合味觉活性值（TAV）和香气活性值（OAV）检测其酶解前后的游离氨基酸及挥发性成分差异，并筛选关键的化合物。旨在为虎掌菌的开发利用以及其风味的深入研究提供实验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

虎掌菌：新鲜无病虫害及瑕疵，购于云南省易门县，鼓风干燥箱烘干，打粉机粉碎放置干燥器备用。

木瓜蛋白酶（食品级，1×105U/g）和风味蛋白酶（食品级，5×104U/g），宁夏和氏璧生物技术有限公司；C7-C30正构烷烃标准品和3-辛醇标准品，美国Sigma公司；硫酸，天津市风船化学试剂科技有限公司。

1.2 设备

PL303型分析天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；PHS-3C型雷磁pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；S-433（D）型氨基酸自动分析仪，德国sykam公司；SCION SQ 456-GC型气质联用仪，美国力可有限公司；DB-WAX型色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），DB-WAX型色谱柱。

1.3 酶解工艺优化

以水解度为指标，分别选取酶解温度（45、50、55、60 ℃），酶解时间（3、4、5、6 h）、木瓜蛋白酶与风味酶复合比例（1:2、1:3、1:1、3:1，m/m）、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶复合添加量（0.20%、0.30%、0.40%、0.50%）、酶解液pH值（6.00、6.50、7.00、7.50）进行单因素试验。

然后根据单因素试验结果，选取对酶解影响比较大的三个因素进行三因素三水平响应面试验设计，因素水平表见表1。

表1 响应面设计因素水平表Table 1 Response surface design factor level table

1.4 水解度测定

氨基酸态氮的测定：根据GB 5009.235-2016《食品中氨基酸态氮的测定》的方法进行测定；总氮的测定:根据GB 5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》的方法进行测定。按照公式（1）计算水解度：

式中：

D——水解度，%；

H1——样品中氨基酸态氮含量，mg/kg；

H2——总氮含量，mg/kg。

1.5 游离氨基酸测定

虎掌菌游离氨基酸的测定：根据GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的测定》的方法使用氨基酸自动分析仪进行检测。

1.6 味觉活性值计算

参考Zhou等[8]的方法，利用味觉活性值（taste activity value，TAV）评价各呈味氨基酸对虎掌菌滋味的影响。按以下公式（2）计算TAV：

式中：

C1——样品含量，mg/kg；

Z1——味觉阈值，mg/kg。

1.7 顶空固相微萃取-GC-MS

样品处理方法：取酶解前后虎掌菌液体样品6 mL于顶空瓶（20 mL）中，插入萃取头萃取30 min（60 ℃）后取出，再插入气相色谱进样口解吸3 min（250 ℃）。

GC条件：色谱柱：DB-WAX石英毛细柱（30 m×0.25 mm×0.25 µm）；柱流量：恒流的模式进样（0.8 mL/min）；载气：高纯度氦气；起始温度40 ℃（3 min），第一阶段5 ℃/min升至90 ℃，第二阶段10 ℃/min升至250 ℃（6 min）。进样口的温度为250 ℃。

MS条件：离子源：EI；离子源温度200 ℃；电压70 eV；色谱-质谱接口温度250 ℃。

1.8 挥发性化合物定性、定量

定性分析：参考Colin等[9]的方法，将质谱得到的化合物数据，包括质核比（m/z）和保留时间及峰面积等数据信息矩阵与软件内置的National Institute of Standards and Technology 14（NIST 14）气相保留指数数据库进行比对得到化合物的信息。定量分析：根据对虎掌菌中挥发性化合物进行分离鉴定时添加3-辛醇为内标物，以内标物的峰面积与气味活性化合物的峰面积比值计算各物质的含量。

1.9 香气活性值计算

参考Tian等[10]的方法，利用香气活性值（Odor Activity Value，OAV）评价各挥发性化合物对虎掌菌酶解前后香气轮廓的影响。按以下公式（3）计算OAV：

式中：

C2——挥发性化合物含量，mg/kg；

Z2——气味阈值，mg/kg。

1.10 数据处理

使用设计专家设计响应面试验，Graphpad Prism 9制作热图及条形图，Origin 2020制作雷达图。使用SPSS 21.0软件分析显著性差异，当p＜0.05时认为具有显著的统计学差异，当p＜0.01时认为极显著。

2 结果与分析

2.1 单因素结果分析

图1 单因素试验结果Fig.1 Single factor test results

酶解过程中其效果的强弱可以由水解度来反映，水解度越高酶解效果越好，释放的化合物越多，因此选择水解度为酶解效果的指标。由图1a～1e所示，在所有五组单因素试验中虎掌菌的水解度呈随着各个变量值先增大后减小的趋势，各个单因素条件下分别在pH值7、时间4.5 h、温度55 ℃、酶添加量0.4%和复合酶的比例为1:1时达到最大值，且最大值时的水解度显著（p＜0.05）高于其他值。图1a中，当pH值为7时样品水解度达到最大56.95%，说明两种酶的最适pH值为7；酶解时间和温度是影响水解度较大的两个因素，当条件相同时两者水解度随着数值增加而增加，但由于酶活性以及底物量的影响，最大的水解度分别在4.5 h和55 ℃时出现（图1b、1c）；酶添加量和复合酶的比例是酶活性的关键，随着酶添加量的增加和木瓜蛋白酶：风味蛋白酶比例增加其活性增强，水解度都出现了显著（p＜0.05）增加的趋势，但是再往上增加时由于反应底物有限以及可能酶活已达到最大，此时水解度出现下降趋势（图1d、1e）。

2.2 响应面结果分析

根据单因素的试验结果，在pH值为7.0、温度为55 ℃的条件下，通过响应面试验进一步优化酶解工艺，结果如表2所示。

对表2数据进行回归分析，结果得到二次多项回归方程为：Y=57.39-2.63A+1.48B-2.05C+4.21AB+2.35 AC+3.34BC-7A2-9.51B2-8.87C2。

表2 响应面设计及结果Table 2 Response surface design and results

表3 回归模型方差分析及模型显著性检验Table 3 Regression model analysis of variance and model significance test

由表3可知，模型p＜0.01、失拟项p=0.17＞0.05拟合度好，回归模型的绝对系数R2=0.9，R2Adj=0.91，说明此模型可以用来描述该酶解工艺。由方差分析结果表明，一次项A，交互项AB和BC，二次项中A2对水解度的影响显著（p＜0.05），二次项中B2、C2对水解度的影响极显著（p＜0.001）。根据F值大小可以判断，影响顺序依次为时间＞酶比例＞酶添加量。

注：左边：立体图；右边：等高线图。

2.3 交互作用分析及模型验证

图2 各因素交互作用响应曲面及等高线图Fig.2 Response surface and contour plot of interaction of various factors

由图2a立体图中可以看出水解度在合适的酶解时间和酶添加量下具有极大值；等高线图可以看出两因素交互的等高线接近椭圆形。由图2b可知，增加酶解时间和酶比例可以提高水解度，但是结果不显著。由图2c可以看出，酶添加量和酶比例的增加，水解度呈现先上升后下降的趋势，说明水解度在适当的酶添加量和酶比例下具有极大值，且在最适范围内酶才能发挥最优效果。在试验模型和结果分析中，酶添加量与酶比例的交互作用对水解度的影响显著（p＜0.05）。

通过模型得到的最优结果为：料液比（虎掌菌:水）1:15、时间4.4 h、酶添加量0.4%、酶比例1:1，水解度57.82%。以此工艺条件进行3组重复试验，得水解度为56.24%，与理论值无显著差异，说明该工艺具有可行性。

2.4 酶解对虎掌菌游离氨基酸的影响

虎掌菌含有接近18.9%的总氨基酸含量，仅次于总蛋白含量（24.9%），对虎掌菌的滋味贡献较大[11]；而酶解会使破坏虎掌菌释细胞壁放更多的游离氨基酸和滋味物质。由表4可知，酶解前呈鲜味的谷氨酸（Glu）和呈甜味的甘氨酸（Gly）含量分别是所有游离氨基酸的最大值4 067.33 mg/kg和806.64 mg/kg，没有检测到酪氨酸（Tyr）；酶解后由于大量蛋白质释放游离氨基酸得17种氨基酸的含量均显著（p＜0.01）增加，特别呈鲜味的谷氨酸（Glu）和呈甜味的甘氨酸（Gly）含量增加到了63 791.23 mg/kg和12 464.51 mg/kg，分别增加了14.68和14.45倍，说明酶解可增强虎掌菌的鲜甜口感，与黄世群等[12]研究的野生黑虎掌菌总氨基酸含量占23.5%的结果类似。酶解后苦味氨基酸显著（p＜0.01）含量增加，但是有研究报道苦味氨基酸不具味觉活性，可被其他呈味氨基酸的味道掩盖[13]，最终使虎掌菌呈鲜甜滋味。

TAV是食物中呈味物质对其整体滋味贡献程度的一个重要的指标，大于1时认为该物质具有强烈的滋味活性，对食物的整体滋味轮廓贡献较大[15]。酶解后，除了半胱氨酸（Cys）、组氨酸（His）、脯氨酸（Pro）、酪氨酸（Tyr）和组氨酸（His）外其余所有氨基酸的TAV均大于1，而且呈鲜味的天门冬氨酸（38.41）和谷氨酸（2 126.38）和总的呈甜味的氨基酸（155.72）TAV大于呈苦味的氨基酸。此外，有研究表明在精氨酸与谷氨酸协同作用下可呈现令人愉快的味道[14]，本研究酶解后的虎掌菌中也检测到了含量1 276.98 mg/kg的精氨酸，且TAV为25.54大于1，对其滋味贡献较大。这些结果表明TAV大于20的天门冬氨酸（38.41）、谷氨酸（2 126.38）、甘氨酸（95.88）、丙氨酸（23.79）、蛋氨酸（24.76）和赖氨酸（53.52）对虎掌菌滋味贡献极大，而且酶解释放了更多的游离氨基酸。酶解前后TAV大于1的呈味氨基酸含量变化如图3所示。

图3 虎掌菌酶解前后游离氨基酸含量变化热图Fig.3 Heat map of Sarcodon aspratus of free amino acid content before and after enzymatic hydrolysis

表4 虎掌菌酶解前后游离氨基酸含量、阈值、呈味特性及TAV值Table 4 The contents, thresholds in water, taste contribution and TVA value of free amino acids in before and after enzymolysis of Sarcodon aspratus

2.5 酶解前后虎掌菌挥发性风味物质的变化分析

酶解前后虎掌菌样品在正、负离子模式下的总离子流如图4所示，反映了样品中特定质荷比的保留时间。

由表5和图5可知，共鉴定出挥发性化合物103种，酶解前55种，酶解后71种；其中包含20个醇、14个酮、8个酸、6个酯、18个烯烃、6个酚、7个杂环、23个醛和1个醚类化合物。酶解后的化合物数量增多，以醛、酮、醇类化合物增加最多，酶解后醇类化合物的含量增加了12 467.1 μg/kg，比酶解前增加了5.35倍；酮、酚、醛和烯烃类化合物含量变化次之。张玉玉等[16]研究发现与牛肝菌粉样品相比，虽然酶解没有增加挥发性成分的总数量，但是酶解增加了酸类挥发性成分。周超等[17]研究发现酶解可以使茶褐牛肝菌的挥发性成分增加（44种），比没有酶解的微波和热风干燥的茶褐牛肝菌的挥发性成分多（分别为19种和18种）。然而，这些挥发性化合物并不一定都来自于蛋白质的分解，脂类受热会分解成脂肪酸，脂肪酸进一步被氧化会分解又能产生醛、酮、酸、内酯、醇、短链脂肪酸酯和烃类等小分子化合物[18]；而且，室温下脂类的自氧化也会产生醛、酮、酸等复杂的挥发性化合物，比如亚油酸可自动氧化生成2-辛烯醛、己醛、乙醛、2-丁烯醛和反式-2-甲基-2-丁烯醛等；脂质自动氧化会生成乙烯酮、3-甲基-2-丁酮、甲基辛基甲酮等脂肪酮；脂质自动氧化也可生成正己醇等醇类[19,20]。本研究酶解后的样品中也检测到了2-丁烯醛、反式-2-甲基-2-丁烯醛、3-甲基-2-丁酮、甲基辛基甲酮和正己醇等挥发性化合物。因此，说明酶解后增加的这些挥发性化合物有部分是来自于虎掌菌酶解过程中脂类物质的分解。

图4 样品的总离子流图Fig.4 Total ion flow diagram of the samples

表5 虎掌菌酶解前后挥发性成分比较Table 5 Comparison of volatile components of Sarcodon aspratus before and after enzymatic hydrolysis

续表5

续表5

图5 虎掌菌酶解前后挥发性风味物质种类（a）及含量（b）Fig.5 Kinds (a) and contents (b) of volatile flavor substances of Sarcodon aspratus before and after enzymatic hydrolysis

醇类主要是赋予食物芳香、花香、甜味、水果味和蘑菇味来增加食物的风味，而且短链醇主要由糖酵解产生，长链醇由氨基酸代谢产生[21,22]。本研究检测到的乙醇、蘑菇醇、糠醇、芳樟醇等主要对虎掌菌的醇香、蘑菇香、甜香和花香等有贡献[23]。醛类主要来源于食物中脂肪酸的氧化和蛋白质的Strecker降解反应，气味阈值较低，因此它们对香气的贡献很大[24]。2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、苯甲醛、苯乙醛、呋喃酮等醛、酮类挥发性化合物具有麦芽味、青草味、甜味、烤面包香、焦糖香和咖啡香等[25]。本研究也鉴定出了苯甲醛、苯乙醛、2-乙酰基呋喃、2,3-丁二酮和香叶基丙酮等，说明虎掌菌含有甜香、花香、咖啡香以及焦糖香等香气。不饱和烯烃如α-白菖考烯、反-菖蒲烯、D-柠檬烯和香叶烯等会呈现特殊的果香和花香[26]，本研究检测到了β-榄香烯、(+)-香橙烯、右旋大根香叶烯和(-)-柠檬烯等烯烃化合物对果香和花香有重要贡献。此外，酸、酯、酚和杂环类物质也被检测到，它们对整体的香气轮廓具有烟熏味、水果香、花香以及奶油香等贡献。

2.6 关键挥发性香气成分及其香气轮廓分析

OAV是评价挥发性化合物对食品香气轮廓贡献度的重要指标，其值大于或等于1的挥发性风味物质为样品的气味活性化合物，对整体风味有直接影响，且OAV越大该化合物对整体香气的贡献就越大[27,28]。

由表6可知，样品解前后OAV≥1的风味物质共有25种，其中酶解前13种、酶解后22种，包括醇类6种、酮类2种、烯烃类2种、酚类1种、呋喃类2种、醛类11种、醚类1种，酶解后的关键香气化合物增多，香气更加丰富。与文献报道一致，本研究中低阈值的醛类对香气是贡献也是最大的，主要贡献青草、脂肪、肥皂、水果香、花香、瓜香、柠檬香等香气；其次是醇类化合物，主要贡献花香、果香、蘑菇香、青草味等，且醛类和醇类物质是样品的风味的主体。相比于酶解前，酶解后所有OAV≥1的醇类物质含量均大幅度增加，增强了虎掌菌花香、果香等香气；此外，2-十一酮、香叶基丙酮酶解后OAV≥100，对水果味和花香贡献极强，正辛醛、苯乙醛、反式-2-癸烯醛和反式-2-壬烯醛OAV也大于100，对青草味、脂肪味以及蜡味、瓜果味香气贡献大。

样品酶解前后的挥发性香气包含了水果香、花香、脂肪香、瓜香、草味、烘烤香、肉香、肥皂味、蘑菇、樟脑和柠檬味。根据风味特征，参照香气轮中的模块分类并将OAV≥1的化合物绘制香气轮廓图[36]。如图6所示，酶解前以水果味、肥皂味、脂肪味、瓜香为主，其次是青草味并配合其他微弱的香气；酶解后所有香气成分含量均增加，使香气轮廓特征更为明显，而且酶解过程产生了1-辛烯-3-醇（OAV=1726）增强了蘑菇香气，此外酶解还释放了更多的呈花香类挥发性化合物（OAV增加了112.34倍）使脂肪、肥皂等不愉快的气味强度减弱。

图6 虎掌菌酶解前后风味轮廓Fig.6 Flavor profile of Sarcodon aspratus before and after enzymatic hydrolysis

表6 虎掌菌酶解前后挥发性风味物质的OAVTable 6 OAV of volatile flavor compounds of Sarcodon aspratus before and after enzymatic hydrolysis

3 结论

虎掌菌菌体粗壮肥大、肉质细嫩、风味优良且富含大量的营养物质，是著名的出口食用菌之一，具有良好的食用和营养价值。本研究通过响应面优化设计试验优化了虎掌菌的酶解工艺，得到最优工艺为：料液比1:15（m/V）、时间4.4 h、酶比例（木瓜蛋白酶:风味酶）1:1、酶添加量0.4%，水解度57.82%，经验证得其水解度为56.24%与预测值接近。然后，检测到共有11个游离氨基酸的TAV大于1，其中天门冬氨酸（38.41）、谷氨酸（2126.38）、甘氨酸（95.88）、丙氨酸（23.79）、蛋氨酸（24.76）和赖氨酸（53.52）大于20，对虎掌菌滋味贡献极大；共鉴定出挥发性化合物108种，酶解前55种，酶解后71种，其中OAV≥1酶解前13种、酶解后22种，样品酶解前后均有水果味、花香味、肥皂味、脂肪味和瓜香的主体香气，酶解后香气全面增强，生成了1-辛烯-3-醇（OAV=1726）使蘑菇香气更明显，且呈花香类化合物OAV增加了112.34倍。为了进一步验证虎掌菌的风味，后续试验应该增加滋味和香气稀释试验以及相应的香气缺失和香气重组试验等。