莲子壳栽培桑黄及子实体抑菌活性研究*

邵晨霞，唐少军，杨 祎，任 锐，吴胜莲，靳 磊，贺月林，许 隽

（湖南省微生物研究院，湖南 长沙 410009）

桑黄类真菌“Sanghuang”是一类珍稀药用大型真菌，包括桑黄属（Sanghuangporus）、木层孔菌属（Phellinus）、纤孔菌属（Inonotus）、嗜蓝抱孔菌属（Fomitiporia）和拟层孔菌属（Fomitopsis）5个属相关菌类，寄主有桑属（Morus）、忍冬属（Lonicera）、丁香属（Syringa）等植物，分布于东亚、北美洲以及非洲中部等地区[1]。关于桑黄最早记载可见《神农本草经》，能治疗痢疾、盗汗、血崩、脱肛泻血、带下、闭经，还具有止泻、延年等功效[2]。研究表明，桑黄类真菌含有多糖、黄酮、萜类和酚类等活性成分，因此是一类具有多种生物活性的药用真菌[3-4]。包海鹰等[5]专家学者对粗毛纤孔菌（Inonotus hispidus）的生境、形态特征和药用功效进行了考证，认为古代中药“桑黄”为粗毛纤孔菌。众多研究表明粗毛纤孔菌子实体具有多种药用功效，如抗衰老、降血脂、抗炎抑菌、提高免疫力、抗肿瘤等，这些特性使桑黄在医药保健方面具有很大的应用潜力[6-9]。

随着人们健康意识的不断增强，桑黄的药用价值受到了广泛关注，通过人工栽培获得高产量、高活性的桑黄子实体是科研工作的重点研究内容。目前桑黄主要采用段木栽培和代料袋栽的方法，但均存在生物转化率低和生长周期长的问题，因此加强人工栽培的技术研发具有重要意义[10]。段木栽培需要大量消耗林木资源，使规模化栽培受到制约，因此代料袋栽应用更广泛。食用菌代料栽培通常以木屑、棉籽壳为主料，近年来棉籽壳价格不断升高，栽培成本也随之增加，需要寻找其他合适的原料来代替棉籽壳[11]。积极拓宽培养料来源，从而降低生产成本，对实现桑黄大规模人工栽培和满足市场需求具有现实意义。

对于桑黄功效方面的研究主要集中在抗肿瘤[9]、免疫调节和抗氧化等[8]方面，关于抑菌活性的研究较少。因此，通过利用莲子壳下脚料做主要原料栽培桑黄，旨在探索成本低、生物转化率高的新型栽培基质配方，通过测定桑黄子实体多糖、黄酮类、三萜类活性成分含量，开展子实体不同溶剂提取物的抑菌效果研究，为桑黄人工栽培产业发展及资源开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源

供试桑黄菌株，由湖南省微生物研究院收集保藏。基于ITS序列进行扩增、测序，比对后鉴定为粗毛纤孔菌（Inonotus hispidus）。

开展抑菌活性试验的大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、白色念珠菌（Candida albicans），由湖南省疾控中心提供。

1.1.2 原种培养料配方

木屑配方：木屑78%，麸皮18%，麦粒2%，蔗糖1%，石膏粉1%。

木屑棉籽壳配方：木屑40%，棉籽壳38%，麸皮18%，麦粒2%，蔗糖1%，石膏粉1%。

麦粒配方：麦粒98%，蔗糖1%，石膏粉1%。

以上各配方的含水量均为55%～60%，pH自然。

1.1.3 栽培种培养料配方

配方1：莲子壳粉30%、木屑40%、麦麸16%、玉米粉10%、葡萄糖2%、石灰1%、石膏1%。

配方2：莲子壳粉40%、木屑30%、麦麸16%、玉米粉10%、葡萄糖2%、石灰1%、石膏1%。

配方3：莲子壳粉50%、木屑20%、麦麸16%、玉米粉10%、葡萄糖2%、石灰1%、石膏1%。

配方4：棉籽壳40%、木屑30%、麦麸16%、玉米粉10%、葡萄糖2%、石灰1%、石膏1%。

配方5：木屑70%、麦麸16%、玉米粉10%、葡萄糖2%、石灰1%、石膏1%。

以上各配方的含水量为55%～60%，pH自然。

1.1.4 主要仪器

LDZX-75L-I立式高压蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2F超净工作台，江苏苏静仪器仪表有限公司；N-1000v-W型旋转蒸发仪，瑞士Büchi公司；TU-1810紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；HH-6恒温水浴锅，常州智博瑞仪器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原种制备

按1.1.2中3个原种培养料配方进行制备。注意制备麦粒培养料时需先将麦粒用常温水浸泡16 h，煮沸约20 min，至麦粒不开花、无硬芯时捞出，滤干后与蔗糖和石膏粉拌匀。采用550 mL的玻璃菌种瓶，装料量为瓶体积的4/5，于121℃高压灭菌2 h。无菌条件下接种，每瓶接种母种2块～4块，塞上棉塞。接种后在26℃遮光条件下培养菌丝，空气相对湿度为55%～65%。观察记录菌丝萌发时间、菌丝长势、菌丝长满瓶的时间及菌丝颜色。

1.2.2 菌袋制备和子实体培养

按1.1.3所述的栽培种培养料配方进行制备。莲子壳需添加3%石灰，提前用水浸泡2 d。配好的料含水量为60%～65%，pH为7.0～7.5，当天配料当天装袋后高压灭菌。采用规格为17 cm×33 cm的聚丙烯塑料袋，每袋装干料约400 g，于121℃高压灭菌2 h。接种量为每瓶原种接25袋栽培种，在26℃遮光条件下培养菌丝，空气相对湿度为55%～65%。待菌丝满袋后，形成颜色稍深的瘤状突起时及时进行出菇管理。将菌袋立式摆放，在距离菌袋上部约3/5处，用无菌刀片划1个长半轴为2 cm，短半轴为1 cm的椭圆口。栽培室温度为25℃～28℃，空气相对湿度为90%～95%，光照强度为300 lx～500 lx，光照时间为8 h，保持通风以提供充足的氧气。待子实体生长50 d～60 d，未弹孢子时及时采收，备用。

1.2.3 菌丝和子实体生长观测

菌丝满袋后，观察并记录满袋时间和开口后原基形成时间。开口后50 d～60 d采收子实体，测量子实体烘干后的总质量。每个配方设3次重复试验，每次重复30个培养袋。

1.2.4 子实体活性成分样品制备

收集的子实体于60℃鼓风干燥箱中烘干至质量恒定，粉碎，过孔径为0.25 mm（60目）筛网，收集粉末，密封保存，备用。

1.2.5 粗多糖含量测定

称取1.2.4的子实体粉末样品各2.0 g，水浴回流提取粗多糖，料水比为1∶30，提取温度为90℃，提取时间为2 h。4 000 r·min-1离心10 min收集上清液，重复操作2次。合并上清液，旋转蒸发浓缩至原体积的1/5，加入无水乙醇使乙醇最终体积分数为80%。4℃条件下沉淀16 h后，4 000 r·min-1离心10 min，沉淀物用蒸馏水定容至100 mL。以葡萄糖为标准品，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量[12]。

1.2.6 黄酮类和三萜类含量测定

称取1.2.4的子实体粉末样品各4.0 g，用70%乙醇超声提取，料液比为1:20，提取温度为55℃，提取时间为60 min。4 000 r·min-1离心10 min收集上清液，重复操作1次。合并上清液，旋转蒸发浓缩回收乙醇，浓缩液用70%乙醇定容至100 mL。以芦丁为标准品，采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法测定黄酮类含量。以齐墩果酸为标准品，采用香草醛-冰乙酸-高氯酸比色法测定总三萜类含量。

1.2.7 抑菌活性试验

参考陈志娜等[13]的方法。称取4份配方2培养料栽培的桑黄子实体粉末1.0 g，分别加入20 mL甲醇、70%乙醇、乙酸乙酯、氯仿，在60 Hz、40℃条件下超声提取30 min。提取液用定性分析滤纸进行真空抽滤，收集滤液，将残渣按照相同条件再提取2次。合并3次滤液，于45℃下旋转蒸发浓缩至干，分别溶于10 mL二甲基亚砜中，得到4种不同溶剂提取物浓缩液（100 mg·mL-1），4℃保存，备用。

采用牛津杯法对桑黄子实体的4种不同溶剂提取物浓缩液进行体外抑菌试验。将活化后的致病菌接种到含800μL LB液体培养料的EP管（1.5 mL）中，在150 r·min-1、37℃条件下振荡培养18 h，用血细胞计数板计数，调整菌悬液的初始浓度至2×106个/mL。将100μL菌液用涂布器均匀涂布在LB固体培养基上。每个平板（直径9 cm）放置2个牛津杯（内径为6 mm，高为10 mm），在牛津杯内分别加入100μL子实体的4种不同溶剂提取物浓缩液，4种不同溶剂为阴性对照，放置在37℃培养箱内培养24 h。采用“十”字交叉法测量抑菌圈大小。

1.3 数据分析

采用SPSS软件对试验数据进行单因素方差分析，并以LSD法检测各处理平均数间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 不同原种培养料对桑黄菌丝生长的影响

桑黄菌丝在3种不同原种培养料上均能生长，生长情况见表1、图1。

表1 不同原种培养料培养桑黄的菌丝生长情况Tab.1 Mycelial growth of Inonotus hispidus cultivated in different substrates of morther spawn

图1 不同原种培养料培养桑黄的菌丝Fig.1 Mycelia of Inonotus hispidus cultivated in different substrates of morther spawn

如表1、图1所示，桑黄菌丝在木屑配方、木屑棉籽壳配方和麦粒配方培养料上的萌发时间分别为3 d、3 d、2 d，菌丝均表现出健壮、浓密，长势旺盛。其中在麦粒配方中的菌丝生长边缘最整齐，满瓶的时间最短（21 d）。麦粒配方的菌丝颜色为深黄色，木屑、木屑棉籽壳配方的菌丝颜色为黄色。综上，3种不同原种培养料均可用于桑黄原种的制备。将桑黄原种接入栽培种培养料进行栽培时，麦粒配方的菌丝联结紧密，不易散开，颗粒度较大；木屑、木屑棉籽壳配方的菌丝结合松散而较易散开，颗粒度较小。

2.2 不同栽培种培养料对桑黄菌丝生长和子实体形成的影响

在相同培养条件下，桑黄在5种不同栽培种培养料上均能生长，生长情况见表2。

表2 不同栽培种培养料培养桑黄的菌丝及子实体生长情况Tab.2 Growth of Inonotus hispidus mycelia and fruit bodies cultivated in different substrates of spawn

如表2所示，5个配方中菌丝均健壮、浓密。配方2的菌丝生长最快，满袋时间最短，为31 d；配方3菌丝满袋时间最长为36 d。子实体原基分化最快的是配方2，为11 d；其次是配方1，子实体原基分化时间为13 d；最慢的是配方4，子实体原基分化时间为17 d。

出菇后子实体生长情况见图2。

如图2所示，桑黄开口出菇初期颜色为浅黄色，子实体质地致密较硬，子实体生长后期颜色逐渐加深至黄褐色，质地稍疏松。采收期停止加湿，子实体会弹射黄色孢子。采收的子实体形态为不规则的球盖形，表面有微细绒毛，子实体横切面有同心环纹路。

2.3 不同栽培培养料对桑黄子实体活性成分含量的影响

在相同培养条件下，不同配方的培养料栽培的桑黄子实体活性成分含量有差异，详见表3。

如表3所示。子实体粗多糖含量配方2最高，为2.69%，其次是配方3，为2.32%，显著高于其他3个配方；子实体粗多糖含量最低的是配方5，为1.71%，显著低于其他4个配方。桑黄子实体黄酮类含量配方2最高，为8.23%；其次是配方4，为7.67%；配方2和配方4子实体黄酮类含量显著高于配方3（7.12%）和配方5（7.21%）。桑黄子实体三萜类含量配方1最高，为1.31%，显著高于其他4个配方。

2.4 桑黄子实体提取物抑菌活性

桑黄子实体4种不同溶剂提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及白色念珠菌3种指示菌都具有良好的抑制效果，详见表4。

表4 桑黄子实体不同溶剂提取物的抑菌活性Tab.4 Antimicrobial activity of different solvent extracts from fruit bodies of Inonotus hispidus

由表4可知，对于大肠杆菌，乙酸乙酯提取物的抑菌活性最好，其次是甲醇提取物，氯仿提取物的抑菌活性最差，与其他3种溶剂提取物的抑菌活性差异显著。对于金黄色葡萄球菌，乙酸乙酯提取物的抑菌活性最好，其次是甲醇提取物，与70%乙醇、氯仿溶剂提取物的抑菌活性差异显著。对于白色念珠菌，甲醇提取物的抑菌活性最好，与另外3种溶剂提取物的抑菌活性差异显著。

3 讨论与结论

选择3个原种培养料配方培养桑黄，菌丝长势旺盛，浓密且粗壮，表明麦粒配方、木屑配方、木屑棉籽壳配方均可用于桑黄原种制种。麦粒配方的桑黄菌丝生长较快，可能是麦粒中丰富的营养成分利于转化利用，多种活性物质可促进菌丝的萌发和生长，从而缩短栽培周期。但接种到栽培种培养料中时，由于麦粒培养料相对其他2种配方的培养料菌丝联结更紧密，因接种操作耗时更长，并且麦粒的成本相对更高，因此生产中可结合实际，综合考虑经济成本等因素选择适宜的配方。

探讨了不同配方栽培种培养料对桑黄菌丝生长及子实体活性成分的影响，在相同培养条件下，添加40%莲子壳粉的培养料菌丝生长最快，满袋时间最短；添加50%莲子壳的培养料菌丝生长最慢，满袋时间最长；这2个配方栽培的子实体干质量较高。以栽培特性为指标，配方2可以加快菌丝生长和子实体形成，缩短栽培周期，显著提高子实体产量，更适用于桑黄人工栽培。

宋永学等[11]研究不同培养方法和培养料配方对人工栽培桑黄的影响，分析认为加入棉籽壳的老桑枝培养料可以促进菌丝生长，子实体产量高，可能与加入棉籽壳后培养料的透气性增加有关。本研究中，加入适量莲子壳的培养料可以促进菌丝生长，可能与其结构疏松增加透气性有关，也可能是由于菌丝分解利用莲子壳中的纤维素、半纤维素和木质素等，转化积累营养从而促进生长发育，具体原因还需要进一步探讨。

目前普遍认为桑黄类真菌中的多糖、黄酮类、萜类、多酚类等物质具有良好的降血糖、调节免疫、抗炎、抗氧化等活性[1,14]。Wang等[15]采用三相分配法从鲍姆桑黄菌中分离得到具有生物活性的胞外多糖，具有较强的自由基清除能力和抗氧化活性。陈志娜等[13]研究桑黄子实体不同溶剂提取物中总黄酮含量、抗氧化和抑菌活性，发现甲醇提取物的总黄酮含量最高，具有较好的抗氧化和抑菌活性。萜类化合物是桑黄主要的生物活性成分之一，杜令娟等[16]研究发现桑黄三萜具有较好的体外降血脂作用。试验中用配方2所栽培的桑黄子实体粗多糖、黄酮类含量最高，但不同栽培基质、栽培模式对其活性物质有何种影响等问题还有待深入研究。

对使用配方2栽培的桑黄子实体开展了抑菌效果试验，4种不同溶剂提取物对3种指示菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及白色念珠菌）都具有一定抑制效果，但不同溶剂提取物对不同指示菌的抑菌效果存在一定差异。有研究表明枯草芽孢杆菌菌株Czk1产生的挥发性物质对橡胶红根病的病原菌，橡胶灵芝菌有抑制作用，可能是通过改变橡胶灵芝菌细胞膜的稳定性，导致其结构受损，扰乱物质代谢活动从而达到抑菌效果[17]。汪天明等[18]研究表明，桑黄正丁醇提取物BAEP对白念珠菌生物膜的形成有一定的抑制作用，抗菌效果明确。桑黄类真菌提取的化合物可抑制某些细菌和真菌的生长[19]，Hong等[20]研究表明桑黄乙酸乙酯提取物可抑制金黄色葡萄球菌合成青霉素结合蛋白，另一方面协同β-内酰胺抗生素增强抗菌作用，但桑黄抑菌活性与其有效成分的相关性和作用机制有待深入研究。

我国莲子加工产生大量利用率较低的副产品莲子壳，利用莲子壳栽培桑黄对其高效利用具有重要意义。莲子壳含有丰富的粗纤维、P和K等营养物质，这些成分均可被食用菌菌丝吸收利用。与其他人工栽培的食用菌相比，目前人工栽培桑黄产量偏低，还有很大的提升空间。为更好的开发利用桑黄，在筛选及优化培养料、探索培养条件、提取子实体中活性物质及应用方面还有待深入研究，其研究成果能为桑黄的规模化人工栽培及产品研发提供参考。