靓丽乳菇菌丝高效扩增培养的方法*

孙举志，陈菲菲，李红英，向 全，杨永康**

（1.恩施土家族苗族自治州农业科学院，湖北 恩施 445000；2.恩施市屯堡乡农业服务中心，湖北 恩施 445026）

乳菇（Lactariusspp.）与松茸（Tricholoma matsutake）、块菌（Tuber melanosporum）、美味牛肝菌（Boletus edulis）等都属于珍稀名贵食用菌，其营养价值高，味道鲜美，颇受人们喜食。乳菇属（Lactarius）真菌为一类外生菌根真菌，依靠与松科（Pinaceae）、壳斗科（Fagaceae）和桦木科（Betulaceae）等植物的根系形成的外生菌根共生体系生长，脱离宿主植物后无法形成子实体[1]。乳菇菌丝与植物根尖接触后能够侵染进入到根的皮层细胞间隙并形成哈蒂氏网[2-3]，即可从植物体内获取营养；且松乳菇（Lactarius deliciosus）等菌根菌的孢子萌发需要植物根系分泌物的刺激诱导[4]。由于乳菇特殊的营养条件及生态条件要求，难以实现大规模人工栽培，目前农贸市场销售的乳菇主要靠野外采集。但常年采集野外乳菇破坏了其菌根生长环境，导致了“产量逐年降低，市场供不应求，产品价格一直居高不下”的恶性循环[5]。

外生菌根类食用菌不同于一般腐生型食用菌，其菌种的分离以及培养都较困难。主要表现为菌丝生长缓慢，菌种的分离培养过程容易被污染，为后期菌种的扩繁以及人工驯化栽培带来了较大挑战。目前，乳菇的栽培已经能够以半人工栽培技术达成，即通过人工合成菌根化苗后移栽至栽培园[6]；其关键技术为利用乳菇菌丝侵染马尾松（Pinus massoniana）的幼嫩根尖建立菌根合成苗共生体[7]。但是，由于菌根的生长发育对宿主植物和土壤微环境均存在一定偏好，往往合成效率不高，且菌根苗移栽至栽培园后至少需要3年~5年才可生长出子实体；生长周期较长、产量较低、土地使用成本高以及栽培和管理面临的技术性问题较多，是菌根苗栽培技术不适合大面积推广应用的根本原因[8]。因此，实现对乳菇的人工驯化栽培一直是菌根真菌研究领域亟待解决的科学问题。此次通过以组织分离得到的靓丽乳菇（Lactarius vividus）为研究对象，开展乳菇菌丝高效扩增培养方法的研究，以期为将来实现乳菇的人工驯化栽培奠定基础，为开展其他类外生菌根真菌的应用研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

乳菇属样品采集自恩施市三岔镇天池山，单株分开，用双层纱布包好后放入低温冷藏箱运送至实验室。

马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）固体培养基，购自上海瑞楚生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的分离

选择颜色鲜艳、无病虫害、菇形圆整、菌盖肥厚且未完全开伞、菌柄完好无损的单生子实体，用作组织分离材料。

先用吹风机吹掉菌盖和菌柄表面杂质，或用卫生纸轻轻擦拭菇体表面；用无菌剪刀剪掉带泥的菌柄基部；徒手沿着子实体将其纵向撕成两半；用解剖刀从内部切取3 mm~5 mm的组织块，放入PDA平板培养基。将平板置于生化培养箱，设置温度为21℃，湿度为60%，进行避光培养。由于不同菌株的萌发能力存在一定差异，且试验过程难免出现污染，因此，每次至少选用5个子实体进行分离试验。

1.2.2 菌株的分子鉴定

将培养得到的菌株（编号esr-1）送至广东美格基因科技有限公司测序。基于ITS序列进行分析，使用Mothur软件进行序列拼接，与NCBI的NT库进行BLAST比对和自动排序，排好的序列用MEGA 7.0中的Neighbor-Joining建系统发育树，外类群为Lactarius salmonicolour。

1.2.3 扩增培养方法

1）传统培养法

在PDA固体培养基表面放上直径为9 cm的无菌玻璃纸；截取菌落边缘的尖端菌丝块，约0.5 mg，大小为0.3 cm2~0.5 cm2，放于平板培养基的玻璃纸上；于生化培养箱避光培养，设置温度为21℃，湿度为60%。每个处理5个重复。

2）组织破碎再培养法

取约0.5 mg新鲜菌块于1.5 mL离心管中，加入800μL无菌水和4颗小钢珠（直径为2 mm）；将离心管放入高通量组织研磨器（SCIENTZ-48），65 Hz条件下破碎1.5 min，所得混合液用于涂布。在PDA固体培养基表面放上直径为9 cm的无菌玻璃纸；取150μL菌丝混合液于平板中央，用玻璃铲均匀涂布；于生化培养箱避光培养，温度为21℃，湿度为60%。每个处理5个重复。

1.2.4 计算菌丝生长速度

采用“十”字交叉法测量菌丝生长速度。待菌丝停止生长后，从平板底部划“十”字形，垂直交叉测量菌落直径，计算平均值，以平均直径（cm）除以生长时间（d）即得菌丝生长速度（cm·d-1）。

1.2.5 计算菌丝干质量

通过称量菌丝干质量反映其总生物量。菌丝停止生长时，将菌丝从玻璃纸上取下，于烘箱中50℃烘干24 h，进行称重。

1.2.6 观察和记录

每隔7天观察菌丝生长状况，包括菌丝浓密程度、是否有瘤状物和分泌物、杂菌污染情况，记录生长时间。

1.2.7 数据分析

菌丝生长速度和菌丝干质量用SigmaPlot进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离与鉴定

取不同的分离部位对乳菇菌丝生长以及分离的成功率大小有较大影响，此次根据郑旋等[9]研究结果，于菌柄和菌盖交界处取内部组织进行培养。子实体形态及分离纯化后的菌丝形态见图1。

图1 乳菇属样品的子实体形态和菌丝形态Fig.1 Morphology of fruit body and mycelia of Lactarius sp.samples

如图1A所示，采集到的子实体颜色为橙色，新鲜无病害；菌盖未完全展开，扁半球形；菌褶较密，与菌盖同色；菌柄健壮，近圆柱形，内部中空。如图1B所示，取菌柄和菌盖交界处的内部组织于PDA培养基培养，萌发形成的菌丝颜色为棕黄色，菌丝粗壮；基质菌丝发达，气生菌丝较弱；菌丝表面有乳黄色液体分泌物，无瘤状物，菌丝浓密，呈放射平铺生长。

将分离获得的菌株esr-1进行ITS测序分析，采用MEGA 7.0软件邻位连接法，进行1 000次的相似度重复计算，外类群为Lactarius salmonicolour。菌株esr-1与相关物种的ITS rDNA序列系统发育树见图2。

图2 基于ITS构建的菌株esr-1系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of strain esr-1 based on ITS

如图2所示，在系统发育树上菌株esr-1以较高的自举支持率与靓丽乳菇Lactarius vividus聚为一支，因此鉴定为靓丽乳菇，又名鲜艳乳菇[10]。将菌的ITS序列提交GenBank数据库，获得相应的登录号为ON318973。

2.2 不同培养方法下菌丝的生长情况

2.2.1 不同培养方式下的菌落形态

采用传统的尖端菌丝纯培养法和菌丝组织破碎再培养法进行菌丝的扩增培养，靓丽乳菇的菌落特征见图3。

图3 不同培养方法下靓丽乳菇菌株esr-1的菌落特征Fig.3 Colony characteristics of Lactarius vividus strain esr-1 under different culture methods

如图3所示，以传统培养法进行培养后，靓丽乳菇的基质菌丝发达，气生菌丝很弱；利用组织破碎仪将菌丝打断后再涂布培养，其基质菌丝和气生菌丝都很发达，菌丝聚集生长，向上隆起形成单个菌落。

2.2.2 不同培养方式下的菌丝生长速度

采用传统培养法和组织破碎再培养法进行菌丝培养，靓丽乳菇菌株esr-1的菌落直径、生长时间详见表1，菌丝平均生长速度见图4。

表1 不同培养方法下靓丽乳菇菌株esr-1菌丝的生长情况Tab.1 The mycelial growth of Lactarius vividus strain esr-1 under different culture methods

如表1和图4所示，传统培养法下，菌丝停止生长时菌落直径为（6.600±0.190）cm，生长时间为（63.000±1.225）d，菌丝平均生长速度为（0.100 0±0.002 4）cm·d-1。组织破碎再培养法，菌落直径为（7.550±0.146）cm，生长时间为（29.000±1.414）d，菌丝平均生长速度为（0.260 0±0.011 7）cm·d-1。将菌丝用组织破碎法打断后再涂布培养，菌丝的生长速度提高160%，培养时间缩短54%，差异达到极显著水平（P＜0.001）。

图4 不同培养方法下靓丽乳菇菌株esr-1菌丝的平均生长速度Fig.4 The average mycelial growth rate of Lactarius vividus strain esr-1 under different culture methods

2.2.3 不同培养方法下的菌丝干质量

采用传统培养法和组织破碎再培养法进行菌丝培养，菌丝长满平板时靓丽乳菇菌丝的干质量见图5。

图5 不同培养方法下靓丽乳菇菌丝的干质量Fig.5 Dry weight of Lactarius vividus mycelia under different culture methods

如图5所示，传统培养法下，菌丝停止生长时靓丽乳菇菌丝的干质量为（0.050 0±0.014 3）g；组织破碎再培养法下，菌丝的干质量为（0.270 0±0.030 5）g，增加440%；两者差异达到极显著水平（P＜0.001），菌丝的生物总量得到极显著增加。由此可见，菌丝的组织破碎法可作为快捷、高效的培养方法。

3 讨论与结论

3.1 组织分离法

在对样品进行组织分离前最好不要用酒精棉球擦拭表面进行消毒，只需要用棉刷清除表面杂质即可。很多报道中用酒精消毒的方法并不值得推荐，因为菌盖表面的杂菌可能会随着酒精渗透进入组织内部，造成污染。更不可使用升汞或次氯酸等其他消毒液，因为这些消毒液会直接影响组织块的萌发。

在分离过程中切忌使用刀片将菌盖切开，因为菌盖表面的杂菌会随着刀刃走过的位置进入组织内部，从而造成污染；直接徒手将子实体掰开，再用无菌刀片挑取内部菌肉组织更能保证分离的成功率。且分离前注意去掉菌柄基部，因为基部土壤杂菌较多。

3.2 乳菇菌丝的高效扩增培养

郑璇等[9]使用PDA培养基培养松乳菇菌丝，第30天时菌落直径只有0.65 cm，之后菌丝停止生长；虽然使用酵母葡萄糖培养基可以提高其菌丝生长速度，但菌落直径最大也只能达到3.2 cm。菌丝经过破碎后再培养，干质量可达0.27 g。而王冉等[7]使用PDA培养基培养的靓丽乳菇，菌丝干质量最大也只有0.13 g，菌落直径为4.03 cm。陈新等[8]综合报道表示，大多乳菇类真菌菌丝的生长速度较为缓慢，需要约45 d～75 d才能长满平板。此次研究结果显示，菌丝用组织破碎仪打断成小片段后再培养，相比传统的培养方法，生长速度提高160%，干质量增加440%，时间缩短54%，菌丝的生长速度和生物量都得到极显著提高。

采用组织破碎仪打断菌丝后再培养，其基本原理为一条菌丝经过打断后变成若干条小片段菌丝，这些菌丝片段又开始以顶端生长方式向前延伸生长，因此极大地提高了接种量，菌丝能相对快速地铺满平板，明显缩短生长周期。相比传统的截取尖端菌丝的传代培养方法，菌丝的组织破碎再培养法具有生长速度快、生物量大、培养周期短等优点，该方法适用于不同培养条件下的乳菇菌丝扩增培养，使用范围广且操作简便。

此次仅对菌丝的扩增培养方式和方法进行了探讨，后续还可以从培养基营养组分上进行研究，除了常用的PDA培养基外，也可以选择BAF、MMN、Pach、MYA等培养基进行筛选[7]。

3.3 未来研究方向

外生菌根类真菌不仅依赖于宿主植物，且与根际土壤微生物也存在密切的联系，菌根、宿主植物、土壤微生物环境三者构成了一个复杂的相互作用体系。菌根形成过程中植物根尖对菌丝体共生信号的识别以及与根际微生物互作机制的研究都值得深入探讨。未来还可以从基因组水平和分类进化水平加强研究，分析菌根真菌与腐生菌的起源以及演化关系。通过基因组测序分析获得可供研究的某些功能基因，例如在乳菇类等共生菌中纤维素酶和木质素酶等相关基因的完整性。克隆相关功能基因，建立成熟的转基因遗传体系，通过转入缺失的关键基因可能有望实现菌根真菌脱离宿主植物形成子实体。