野生中华猕猴桃对细菌性溃疡病的抗性评价

李 黎，潘 慧，李文艺，韩 飞，胡光明，张 琦，钟彩虹

(1.中国科学院 植物种质创新与特色农业重点实验室，武汉 430074;2.中国科学院 猕猴桃产业技术工程实验室，武汉 430073;3.中国科学院 种子创新研究院，武汉 430022;4.中国科学院 武汉植物园，武汉 430074)

猕猴桃富含多种维生素和矿质元素，被誉为“水果之王”，是20世纪野生果树成功驯化栽培的典范.中国是猕猴桃属植物的原产地和栽培品种的发源地，目前种植面积已超越意大利、新西兰及伊朗等各国的种植面积总和，2020年产量占全球总产量的68%，成为世界最大的猕猴桃生产国[1].目前，我国猕猴桃商业化栽培以中华猕猴桃(Actinidiachinensisvar.chinensis)及美味猕猴桃(A.chinensisvar.deliciosa)为主.其中，中华猕猴桃因其果面光滑，品质及口感尤佳，近年来逐渐受到消费者喜爱[2].

2010年以来，由丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种[Pseudomonassyringaepv.actinidiae(Psa)]引起的细菌性溃疡病在我国各猕猴桃主产区暴发，平均病株率超过40%，死树、毁园情况频发，累计感病面积超过十万公顷，给我国猕猴桃产业造成了重大经济损失.溃疡病主要症状发生在早春，植株主干和枝条龟裂，病部皮层水渍状软腐，早期伴有乳白色黏质菌脓，伤流期转为黄褐色或锈红色菌脓.随后，叶片上出现伴有黄色晕圈的不规则形褐色斑点，叶片焦枯卷曲、枯稍，花蕾变褐枯死并脱落.最后，随病情加重，影响养分输送吸收，树势逐渐衰弱直至树体死亡[3].多项研究证实中华猕猴桃品种的溃疡病抗性整体较差，‘红阳’‘早鲜’‘金丰’‘云海1号’‘楚红’及‘Hort16A’等均被鉴定为高感品种[4-5].

尽快研究并解决溃疡病对产业威胁的问题已成为当前国内外猕猴桃研究的首要命题.生产实践证明，相对于栽培措施和化学药剂防治，利用抗病品种防治是最为理想的病害控制途径.中国野生猕猴桃资源种类、储量及遗传多样性均非常丰富，野生资源历经长期的自然选择，可能含有高抗种质，可作为猕猴桃抗病基因改良的重要材料[6].因此，对中华猕猴桃野生种质进行溃疡病抗性评价迫在眉睫.国内前期研究主要针对已有品种进行抗性评价，仅张敏等[7]对贵州产区黄肉猕猴桃品种的4株优系进行了溃疡病抗性评价.本研究利用离体枝条人工病菌接种方法，对在国家猕猴桃种质资源圃收集自7个省份的129份中华猕猴桃野生种质进行了全面的溃疡病抗性鉴定及评价，筛选抗性种质资源，为后续进行抗病选育及抗性机理研究提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 溃疡病菌株 采集自我国湖南省常德市东山峰农场(中国猕猴桃溃疡病最早感病园区，东经110°41′42.36″，北纬29°55′1.56″)的C48菌株，经生物学特性及全基因组SNP分型鉴定，确定为目前全球流行的Psa3型强致病力菌株[8].

1.1.2 待鉴定的猕猴桃种质 129份中华猕猴桃野生种质均由国家猕猴桃种质资源圃收集，其中72份来自安徽、36份来自四川、11份来自湖南、7份来自浙江、1份来自湖北、1份来自江西、1份来自江苏，具体收集时间及地点如表1所示，收集后翌年2月嫁接，目前均保存在国家猕猴桃种质资源圃主圃内(中国科学院武汉植物园猕猴桃园).已报道的2个国内主栽品种溃疡病高感中华猕猴桃品种‘红阳’及耐病美味猕猴桃品种‘徐香’设置为对照[5]，均栽培在国家猕猴桃种质资源圃主圃内.

1.2 实验方法

1.2.1 细胞染色体倍性测定 采用Cy-Flow Space 流式细胞仪(德国Partec公司)对新鲜幼嫩叶片进行倍性测定[9]，将二倍体中华品种‘红阳’(2n=2x=58)设置为标准品.取小块叶片置于含1 mL细胞裂解液(混和1% PVP溶液)的培养皿中并用刀片迅速切碎，裂解30 s后加入1 mL 5 μg/mL的DAPI染色液进行细胞核DNA染色标记，放置30 s后用400目滤膜过滤，收集滤液于EP(eppendorf)管，上样后记录结果，标准品出峰的相对荧光强度设置为50，待测样本的倍性记录=参照样本的倍性值×(待测样本的荧光强度值/参照样本的荧光强度值).实验过程如图1所示.

图1 实验过程示意图Fig.1 Schematic diagram of experimental process

(a)高抗种质‘HB 3021’;(b) 中抗种质‘JX B2755’;(c) 低抗种质‘SC B2585’;(d) 耐病种质‘HN B2324’;(e) 低感种质‘AN B3211’;(f) 中感种质‘AN B3343’;(g) 高感种质‘AN B2982’.图2 7个抗性等级代表性种质的病斑症状Fig.2 Diseaselesion symptoms of representative germplasm of seven resistance categories

1.2.2 菌株活化及培养 活化培养C48菌株，挑取单菌落加入1 mL液体KB培养基中，28 ℃、180 r/min振荡培养12 h，8 000 r/min离心5 min，取沉淀，用无菌水将病菌悬浮液稀释109cfu/mL.

1.2.3 采用离体枝条进行接种 ① 枝条采集：对每份待鉴定种质，于猕猴桃落叶休眠期(11-12月)采集直径约为0.8 cm的1年生健康且长势一致的木质化枝条，剪成10 cm一段的小枝条，用封口膜封住枝条的两端，减少水分流失，并按株号做好标记.每种种质设置6个重复.② 枝条接菌：用5%乙醇对每根枝条进行表面消毒，无菌水清洗2遍，晾干.随后，用无菌刀片在枝条上等间隔切割伤口，切口宽2 mm，深至韧皮部，切口上各滴10 μL的菌液.③ 枝条培养：待菌液渗透进枝条伤口后，将伤口朝上放置在底部铺有湿滤纸的托盘中，再用薄膜覆盖枝条保湿，托盘内湿度保持在80%左右，置于16 ℃、16 h光照/8 h黑暗的条件下培养27 d.④ 病斑测量：枝条培养27 d时用无菌刀削去枝条皮层，测量病菌侵染后在枝条上造成的褐色病斑长度.

1.2.4 抗性等级评价 基于枝条病斑长度对种质进行抗性等级划分,相较于裴艳刚[4]及王发明等[10]的方法，对抗性等级进行了更详细的划分.① 高抗(high resistant,HR)：病斑长度≤3.0 cm；② 中抗(moderate resistant,MR)：3.0 cm<病斑长度≤4.0 cm；③ 低抗(low resistant,LR)：4.0 cm<病斑长度≤5.0 cm；④ 耐病(tolerant,T)：5.0 cm<病斑长度≤6.0 cm；⑤ 低感(low susceptible,LS)：6.0 cm<病斑长度≤7.0 cm；⑥ 中感(moderate susceptible,MS)：7.0 cm<病斑长度≤8.0 cm；⑦ 高感(high susceptible,HS)：病斑长度>8.0 cm.

1.3 数据统计

采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析，单因素(one-way ANOVA)Duncan’s新复极差法进行方差分析，表中数据用平均值±标准误差表示.

2 结果与分析

2.1 溃疡病抗性鉴定结果

基于枝条病斑长度分析‘红阳’及‘徐香’对照品种的抗病等级，证实‘红阳’属于高感等级，‘徐香’属于耐病等级.将129份中华猕猴桃野生种质划分为7个抗性等级,如图2和表1所示，发现其中含高抗种质1份——二倍体种质‘湖北3021’(占比0.77%)，中抗种质1份——二倍体种质‘江西B2755’(占比0.77%)，低抗种质3份——四倍体种质‘四川B2585’、二倍体种质‘湖南B2243’及‘湖南B2244’(占比2.33%)，耐病种质5份(占比3.88%)，低感种质25份(占比19.38%)，中感种质15份(占比11.63%)及高感种质79份(占比61.24%).由此可见，中华猕猴桃野生种质整体抗性较差，抗性种质比例仅为3.87%，耐病种质比例为3.88%，感病种质比例高达92.25%,如图3(a)所示.

2.2 溃疡病抗性与地域之间的关系

基于采集区域进行抗性分析，发现安徽省及四川省样本数目相对较多，可用于分析抗性材料比例；其中安徽省收集的72份种质中不含抗病种质，含耐病种质3份(占比4.17%)，低感种质15份(占比20.83%)，中感种质11份(占比15.28%)，高感种质43份(占比59.72%)，所图3(b)所示.四川省收集的36份种质中含低抗种质1份——四倍体低抗种质‘四川B2585’(占比2.78%)，低感种质8份(占比22.22%)，中感种质3份(占比8.33%)，高感种质24份(占比66.67%)，如图3(c)所示.综合分析发现安徽省及四川省中华猕猴桃野生种质中抗病种质的比例均较低，感病种质比例均高于95%，其中四川省抗病种质比例略高于安徽省.湖南、浙江、湖北、江西及江苏等省份的样本数目较少，暂未进行抗性与地域间的关联分析.

表1 129份中华猕猴桃野生种质的病斑长度及抗性等级分析Tab.1 Disease lesion length and resistance categories analysis of 129 wild A.chinensis var.chinensis germplasm resources

续表1

续表1

2.3 溃疡病抗性与倍性之间的关系

从染色体倍性角度而言，129份种质中含二倍体材料94份，其中高抗二倍体种质‘湖北3021’1份，中抗二倍体种质‘江西B2755’1份，低抗二倍体种质‘湖南B2243’及‘湖南B2244’2份，耐病种质3份，低感种质18份，中感种质11份，高感种质58份；对应抗性种质比例为4.26%，耐病种质比例为3.19%，感病比例为92.55%，如图3(d)所示.四倍体种质35份，其中低抗四倍体种质‘四川B2585’1份，耐病种质2份，低感种质7份，中感种质4份，高感种质21份；对应抗性种质比例为2.86%，耐病种质比例为5.71%，感病比例为91.43%，如图3(e)所示.筛选得到的5份抗病种质中‘四川B2585’为四倍体种质，‘湖北3021’‘江西B2755’‘湖南B2243’及‘湖南B2244’均为二倍体种质.由于四倍体种质数目较少，未筛选到高抗及中抗种质，因此无法横向比较四倍体种质和二倍体种质的抗病性.

图3 129份种质整体抗性分析及按照地域、倍性单独分析Fig.3 Overall resistance analysis of 129 germplasms and the individual analysis accordng to region and ploidy

3 讨论

近年来，运用离体木质化枝条接种溃疡病菌，观察病斑长度以鉴定猕猴桃种质抗性的方法逐步得到应用，国内外研究均证实枝条病斑长度及组织菌量浓度、田间感病情况之间呈显著正相关性，不同年份离体枝条接种的感病情况基本一致并达到极显著相关水平[11-12].石志军等[5]及强遥[13]分别基于离体枝条病斑长度对24及23个猕猴桃品种的溃疡病抗性进行了分级，证实‘徐香’的抗性明显优于‘红阳’.本研究基于相同分析方法及评定标准，以中华品种‘红阳’及美味品种‘徐香’为对照，对收集自7个省份的129份中华猕猴桃野生种质的溃疡病抗性进行了评价.研究结果表明‘红阳’及‘徐香’分别被鉴定为高感及耐病品种，证实了运用离体枝条实验进行大规模中华猕猴桃野生种质抗性评价的可靠性.

无论从整体抗性、采集地域或倍性角度分析，本研究结果均显示中华猕猴桃野生种质中的抗病种质比例低于4%，整体抗性较差，但同时证实野生中华猕猴桃中仍含有抗病种质.被鉴定为高抗溃疡病的二倍体种质‘湖北3021’采集自湖北省孝感市山区，果实较小、长梭形，果面被极短茸毛，果肉黄色、肉质细嫩、风味甜酸适宜，成熟早，适合作为育种亲本材料.其他4份抗性材料经驯化保存，今年刚进入结果期，暂未得到果实品质鉴定结果，但树势均较强旺.特别关注的是从湖南收集的11份野生种质中，鉴定到了2份低抗种质、1份耐病种质，分别占比18.18%和9.09%，结合早期从湖南野生资源中培育的中抗品种‘翠玉’[6]和低抗品种‘湘麻6号’(按照本文评价方法，湖南省园艺所早期从麻阳县西晃山采集野生种质并驯化选育的四倍体品种‘湘麻6号’被鉴定为低抗等级)，证实在野外资源中筛选抗病种质作育种亲本或直接驯化成为优异品种是可行的.此外，仲伟敏等[14]对贵州黔东南地区收集到的1份黄肉野生猕猴桃单株进行洗种播种，监测了其198份黄肉野生猕猴桃实生株系的田间溃疡病抗性，发现实生苗后代的溃疡病抗性差异明显，初步筛选出4株具有优良抗性且风味品质较好的雌株实生苗，证实利用中华猕猴桃野生种质进行实生选育筛选获得优质抗性品种这一方向也是可行的.

近年来，基于生理、生化、转录组学及代谢数据，国内外多项研究系统分析了中华猕猴桃抗性较差的原因，发现与软枣猕猴桃、毛花猕猴桃等中抗性品种及美味猕猴桃中的‘布鲁诺’‘徐香’等耐病品种相比，中华猕猴桃易感品种‘红阳’及‘楚红’等品种的组织结构、酚类物质、可溶性蛋白及糖含量、防御性酶活表达及抗病相关防御基因的表达机制等方面均存在明显差异[15-23].然而，迄今为止国内外仍未找到关键的猕猴桃溃疡病抗病基因，无法开发高效的抗性标记用于中华猕猴桃种质资源的大规模抗性评价或精准抗病育种.

本研究结果表明，虽然中华猕猴桃野生种质的整体溃疡病抗性较差，但仍有希望筛选到抗病种质.针对本研究筛选到的5份野生抗病种质，二倍体高抗种质‘湖北3021’、二倍体中抗种质‘江西B2755’、四倍体低抗种质‘四川B2585’、二倍体低抗种质‘湖南B2243’及‘湖南B2244’，可进一步对其进行综合鉴定，对优异种质直接培育成品种，或作为育种亲本，或直接洗种子实生驯化，从中培育既高抗又优质的新品种，根本上解决产业上优质而不抗病的问题.此外，可将上述抗性种质用作中华种内抗性杂交的抗病亲本，构建抗感F1杂交群体进行抗病基因的QTL定位，用于分子抗性机理研究及关键抗病基因挖掘验证，加快中华猕猴桃抗性育种进程.