氧化苦参碱靶向EGFR抑制胶质母细胞瘤细胞谷氨酰胺代谢

陈 立 王 承 郝必烈

胶质母细胞瘤(glioblastoma, GBM)是成人中最常见和最具侵袭性的原发性脑肿瘤,恶性GBM 患者的预后极差,5年生存率低于5%[1]。 因此,理解GBM 的分子基础和发生过程对于有效治疗GBM 具有重要意义。 目前,肿瘤能量代谢异常已逐渐成为肿瘤学研究的热点之一。 除了葡萄糖和Warburg 效应之外,谷氨酰胺(glutamine)代谢上调也成为多种肿瘤的特征之一[2]。 谷氨酰胺是肿瘤生长所必需的氨基酸,肿瘤细胞需要异常的谷氨酰胺代谢来促进其生长、增殖和存活。 有研究显示,抑制谷氨酰胺代谢可以显著抑制胶质瘤细胞的生长、迁移和侵袭能力[3]。此外,有研究发现,谷氨酰胺代谢在GBM 中发挥着重要的调节作用[4]。 氧化苦参碱(oxymatrine,OMT)作为苦参的主要生物碱提取物之一,具有抗病毒、抗纤维化、抗炎和抗心律失常等多种药理作用[5]。 近年来研究表明,OMT 对多种类型的肿瘤具有抑制作用[6]。 然而,OMT 对于GBM 的作用目前还鲜有研究报道。 表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)的遗传改变发生在约50%的GBM 患者中。 有研究发现,EGFR 在包括GBM 在内的胶质瘤的代谢异常中发挥关键作用。 由于其磷酸酶活性,EGFR 可以激活Ras 和PI3K 以促进Warburg 效应和脑肿瘤发生[7]。 近年来研究发现,EGFR 通过MEK/ERK/ELK1 通路促进GBM 中的谷氨酰胺代谢[8]。 此外,OMT 被发现可以靶向胃癌细胞中EGFR,从而抑制胃癌细胞的增殖和侵袭[9]。 因此,研究OMT 是否可以通过EGFR 调控GBM 中谷氨酰胺代谢水平,可以为临床上OMT 治疗GBM 提供可靠的理论依据,为改善GBM 的代谢异常提供有潜力的治疗靶点。

材料与方法

1.细胞株与主要试剂： 人胶质母细胞瘤细胞系U251(TCHu58)、U87(TCHU138)均购自中国科学院细胞库(上海)。 一抗p-EGFR(#3777)、EGFR(#4267)和GAPDH(#5274)均购自美国Cell Signaling Technology 公司。 CCK-8 试剂盒(CK04-500)购自日本 Dojindo 同仁化学研究所。 EdU 试剂盒(C103103)购自广州锐博生物有限公司。 α-KG(ab83431)、 GSH/GSSG (ab138881)、 谷氨酰胺(A073)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

2.细胞培养： 细胞在含有10%胎牛血清的Dulbecco 改良Eagle 培养基(DMEM)中进行培养,并置于5% CO2、37℃的加湿培养箱中。

3.CCK-8 检测细胞活力： 将细胞接种至96 孔板(1 × 104个/孔) 中,于37℃下孵育过夜。 经过OMT 和(或)EGF 处理后,加入10μl 试剂,于37℃下孵育4h,通过酶标仪检测每孔细胞在波长450nm 处的吸光度(A)值,并计算细胞活力(%) = (细胞总数-死细胞数)/细胞总数×100%。

4.EdU 检测细胞活力： 取对数期生长细胞,接种至96 孔板(1 ×105个/孔)中,于37℃下孵育过夜。经过OMT 和(或)EGF 处理后,按照说明书通过细胞培养基稀释EdU 试剂,并制备EdU 培养基。 每孔加入100μl 50μmol/L 的EdU 培养基孵育2h,清洗后对细胞固定化,进行染色、观察。

5.谷氨酰胺代谢标志物检测： 取2 ×106个细胞在PBS 中匀浆,收集上清液,并通过10kDa Amicon Ultra Centrifugal Filters 去除蛋白质,按照说明书,检测流通液中α-KG、GSH/GSSG 的水平。 对于谷氨酰胺的检测,将细胞培养在24 孔板中,于37℃下孵育过夜。 收集培养基,按照说明书检测谷氨酰胺的消耗水平。

6.蛋白免疫印迹检测细胞中EGFR 蛋白水平：细胞经过处理后,通过SDS 提取总蛋白,细胞裂解液在4℃下以10000r/min 离心30min。 测定蛋白浓度后,通过10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质并转移至PVDF 膜上。 5% 脱脂牛奶封闭1h 后,4℃过夜孵育一抗。 洗涤后,孵育辣根过氧化物酶偶联的二抗,室温下孵育2h。 通过增强型化学发光试剂盒检测待测物表达情况。

7.统计学方法： 应用Graphpad 8.0 统计学软件对数据进行统计分析,计量数据以均数± 标准差(±s)表示,每个处理重复3 次,多组间比较采用单因素方差分析,以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1.OMT 抑制GBM 细胞生长：为了研究OMT 在GBM 肿瘤进展中的潜在作用,本研究选用了U87 和U251 两种GBM 细胞系。 通过CCK-8 检测不同浓度的OMT 处理12、24、48h 时的细胞活力(图1A)。对于两种细胞系,当OMT 为2mg/ml 时,在48h 后细胞活力相当于未处理细胞的50%。 结合EdU 检测结果(图1B)均表明,OMT 以剂量依赖性方式有效抑制GBM 细胞的生长。

图1 OMT 抑制GBM 细胞生长

2.OMT 抑制GBM 细胞中谷氨酰胺代谢：本研究评估了OMT 对GBM 细胞谷氨酰胺代谢的作用。 通过2mg/ml 的OMT 处理GBM 细胞48h,测定了谷氨酰胺重要代谢物α-KG 的水平,结果显示,在OMT处理的细胞中α-KG 水平显著下降(图2A)。 此外,谷氨酰胺的副产物GSH/GSSG 在OMT 处理后也被抑制(图2B),谷氨酰胺消耗(谷氨酰胺向谷氨酸的转化)也下降(图2C)。 综上所述,OMT 会抑制GBM细胞中谷氨酰胺代谢。

图2 OMT 抑制GBM 细胞中谷氨酰胺代谢

3.OMT 靶向抑制GBM 细胞中EGFR 的表达水平：为了研究OMT 是否通过EGFR 抑制GBM 细胞的谷氨酰胺代谢,首先测定了OMT 处理后EGFR 的表达情况。 图3A 显示,OMT 处理会显著抑制p-EGFR蛋白表达。 因此,为了研究EGFR 对GBM 细胞的影响,首先通过能够激活EGFR 通路的配体EGF 来上调GBM 细胞中EGFR 的表达。 结果显示,通过50ng/ml 的EGF 处理细胞15、30、60min 后,细胞中p-EGFR 表达随着EGF 刺激时间的增加而升高(图3B)。

图3 OMT 靶向抑制GBM 细胞中EGFR 的表达水平

4.EGFR 促进GBM 细胞中谷氨酰胺代谢：分别在EGF 处理细胞15、30、60min 后,测定谷氨酰胺代谢标志物的水平。 试剂盒检测结果显示,两种GBM细胞系种,谷氨酰胺重要代谢物α-KG、谷氨酰胺的副产物GSH/GSSG、谷氨酰胺消耗水平均随着刺激时间增加而升高(图4)。 这些结果说明,EGF 激活的EGFR 会促进GBM 细胞中谷氨酰胺代谢水平。

图4 EGFR 促进GBM 细胞中谷氨酰胺代谢

5.OMT 靶向EGFR 抑制GBM 细胞中谷氨酰胺代谢：为了验证OMT 是通过EGFR 抑制GBM 细胞中谷氨酰胺代谢,本研究经OMT 处理细胞,并通过EGF 激活EGFR 表达(图5A),测定细胞中谷氨酰胺代谢标志物的水平。 结果显示,由OMT 处理抑制的α-KG、GSH/GSSG、谷氨酰胺消耗的水平,能够被EGF 激活的EGFR 显著逆转(图5 中B ～D)。OMT 靶向EGFR 抑制GBM 细胞中谷氨酰胺代谢。

图5 OMT 靶向EGFR 抑制GBM 细胞中谷氨酰胺代谢

讨 论

苦参(Sophorae flavescens)是一种传统的中草药,是苦参艾的干燥根。 苦参在《神农本草经》中首次被记载,用于炎症、实体瘤等疾病治疗。 苦参主要包括生物碱、黄酮类、烷基氧杂蒽酮、醌类、三萜苷、脂肪酸和精油等化学成分[10]。 其中,氧化苦参碱(oxymatrine,OMT)是苦参的主要生物碱提取物之一,在不同类型的肿瘤中均发挥抑制作用[11]。 OMT 在不同的肿瘤中靶向调控的基因是不同的,其发挥抑癌作用的分子机制也是不同的。 近年来,肿瘤能量代谢的作用受到越来越多的关注。 既往研究发现,OMT 通过调节丙酮酸激酶M2 介导的有氧糖酵解,对结直肠癌细胞转移发挥抑制作用[12]。 糖酵解是能量代谢中葡萄糖代谢的一种,癌细胞以高速率但低效率的方式消耗大量葡萄糖,以提供ATP 并产生乳酸,这也被称为Warburg 效应[13]。 然而OMT 是否会参与谷氨酰胺代谢及其明确的分子机制尚不完全明确。 本研究发现,OMT 能够抑制GBM 细胞的谷氨酰胺代谢过程、抑制细胞生长。

谷氨酰胺被认为是正常生物体中的非必需氨基酸,它对大多数癌细胞的快速增殖和生长至关重要[14]。 肿瘤细胞通过细胞膜上大量的转运蛋白吸收谷氨酰胺,并在谷氨酰胺酶的催化下将谷氨酰胺转化为谷氨酸[15]。 谷氨酸可以进入细胞质或线粒体,作为底物,进一步转化为α-酮戊二酸(α-ketoglutarate, α-KG),维持三羧酸(tricyclic acid, TCA)循环的稳定运行,产生ATP,为肿瘤细胞提供碳源和氮源作为能量,用于维持细胞氧化还原稳态和脂肪酸合成[16]。 因此,谷氨酰胺代谢被认为肿瘤细胞代谢除Warburg 效应之外的另一大特征。 近年来,越来越多的研究证实,针对谷氨酰胺代谢的治疗可以有效抑制多种肿瘤的进展[17]。

EGFR 是一种属于酪氨酸激酶受体家族的糖蛋白,与各种肿瘤的发生和发展以及肿瘤的入侵和转移有着千丝万缕的联系[18,19]。 EGFR 的激活与细胞增殖、侵袭和GBM 复发显著相关[20]。 此外,EGFR 在GBM 的代谢异常中起重要作用。 EGFR 诱导的Max选择性剪接促进胶质瘤中的葡萄糖代谢和肿瘤生长,抑制EGFR 驱动的糖酵解诱导GBM 细胞凋亡[21]。此外,非小细胞肺癌中,EGFR 突变会引起谷氨酰胺酶的表达水平升高[22]。 本研究发现,EGFR 能够促进GBM 细胞中重要代谢物α-KG、谷氨酰胺的副产物GSH/GSSG、谷氨酰胺消耗增多,促进谷氨酰胺代谢。并且OMT 会抑制GBM 细胞中EGFR 的表达来发挥谷氨酰胺代谢的抑制作用。

综上所述,对GBM 细胞进行OMT 治疗,能够显著抑制GBM 细胞生长及谷氨酰胺代谢,而OMT 可能通过抑制EGFR 的表达水平发挥上述作用。 本研究结果有助于发现治疗GBM 的新型低分子化合物,并为阐明新的药效靶点提供一定的药理学基础。