血清中雌激素及其代谢产物在子宫内膜非典型性增生诊断中的意义

赵焕焕，杨红芳，李俊玉，李志伟，白 雪，葛钟桓，周 梅，李 利△

(1.河北医科大学第四医院妇科，石家庄 050011；2.河北科技大学化学与制药工程学院，石家庄 050018；3.河北省沧州市南皮县医院妇科 061500)

子宫内膜癌是发达国家中最常见的妇科恶性肿瘤，其中Ⅰ型子宫内膜癌为雌激素依赖型，大多数与肥胖和代谢综合征密切相关，Ⅱ型子宫内膜癌为非激素依赖型，与雌激素刺激关系不大[1]。通常认为Ⅰ型子宫内膜癌是通过子宫内膜前体病变及分子遗传学改变的累积而发展的[2]，2014年第4版世界卫生组织(WHO)女性生殖系统肿瘤分类中将子宫内膜病变分为两大类：非典型性增生/子宫内膜上皮内瘤变(AH/EIN)和不伴非典型性增生[3]。临床观察表明，子宫内膜非典型性增生与子宫内膜长期受雌激素刺激有关，并且子宫内膜非典型性增生进展为Ⅰ型子宫内膜癌的风险高达约30%[4]。因此，区分子宫内膜伴与不伴非典型性增生具有重要的临床意义，迄今为止，子宫内膜增生的诊断和随访需要侵入性手术[5]。

目前，子宫内膜癌及癌前病变缺乏敏感性及特异性较高的血清肿瘤标志物，探索更多的标志物对于子宫内膜癌及癌前病变的诊治有很高的临床价值[6]。质谱法测量内源激素的使用为此类研究开辟了新的研究途径，该方法除了灵敏度高、准确度高和具有可重复性之外，其还能够同时测量雌激素代谢产物[7]。笔者前期研究已经发现尿液中雌二醇(E2)、4-羟雌二醇(4-OHE2)、雌酮(E1)、2-甲氧雌二醇(2-MeOE2)、16α-羟雌酮(16α-OHE1)可作为子宫内膜癌患者的肿瘤标志物[8]，但是目前国内外尚无报道雌激素及其代谢产物在子宫内膜非典型性增生患者中表达情况的研究，本研究采用高效液相色谱技术检测子宫内膜非典型性增生患者的血清中雌激素及其代谢产物水平，探讨血清中雌激素及其代谢产物水平在子宫内膜非典型性增生患者血清中的表达及意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2019年1月至2020年1月于河北医科大学第四医院妇科就诊的异常子宫出血并疑似子宫内膜病变患者，经宫腔镜检查及子宫内膜病理活检确诊为子宫内膜不伴非典型性增生患者80例(不伴非典型性增生组)，患者平均年龄为(40.5±6.5)岁，其中非肥胖组45例，肥胖组35例，收集阴道出血期的血清标本；子宫内膜活检证实为子宫内膜非典型性增生患者，并且经子宫切除手术术后病理确诊为子宫内膜非典型性增生患者70例(非典型性增生组)，收集阴道出血期的血清标本，患者平均年龄为(47.8±1.92)岁；其中非肥胖组39例，肥胖组31例，收集阴道出血期的血清标本；所有研究对象手术前至少3个月未接受药物疗法，并签署研究知情同意书。选择同期来该院行体检的绝经前妇女60例为对照组，经过B超评判子宫内膜无增厚，无异常出血，月经规律，既往无子宫内膜病变的健康人60例，平均年龄为(42.6±3.8)岁，其中非肥胖组30例，肥胖组30例，收集月经来潮第2～3天血清标本。排除吸烟、乳腺疾病、妇科肿瘤及其他激素有关的肿瘤，合并高血压或糖尿病者，合并严重心肝肾肺疾病者，合并急慢性感染者。其中BMI≥25 kg/m2定义为肥胖。

1.2 主要试剂与仪器

AB 4500 三重四级杆质谱仪(Triple Quad 4500/LC-20AD)购自美国Sciex公司；电子天平Q65-1CN购自德国Sartorius公司；乙腈、甲醇购自德国Merck公司；甲酸、正辛醇、丙酮、氢氧化钠、盐酸购自天津大茂公司；E2标准品购自美国Sigma-Aldrich工资；E1标准品、4-OHE2标准品、16α-OHE1标准品、2-MeOE2标准品购自加拿大TRC公司。

1.3 方法

1.3.1血清采集

收集清晨空腹血样标本4 mL,置于促凝管中，加入20 μL维生素C防止氧化，2 h内送实验室，并以2000 r/min离心10 min后，分离血清，将血清保存在-80 ℃直至使用。

1.3.2超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)检测方法

1.3.2.1色谱条件

色谱柱：Luna Omega 3 μm polar C18 100 mm×2.1 mm，柱温40 ℃；流动相A相0.1% 甲酸水溶液,B相0.1% 甲酸乙腈溶液；流速0.4 mL/min，梯度为1 min为-90% A，10 min为-40% A，11～12 min为-90% A，进样量10 μL。

1.3.2.2标准溶液制备

(1)量取各标准品对溶液(除E2)50 μL、雌二醇500 μL，混合，用10%乙腈稀释至5 mL，即各激素浓度均为10 μg/mL。(2)取对照储备液50 μL，用10%乙腈稀释至1 mL，即得500 ng/mL血清样品；(3)取溶液(2)200 μL，用10%乙腈稀释至1 mL，即得100 ng/mL血清样品；(4)取溶液(2)100 μL，用10%乙腈稀释至1 mL，即得50 ng/mL血清样品；(5)取溶液(4)200 μL，用10%乙腈稀释至1 mL，即得10 ng/mL血清样品。

1.3.2.3样品制备

取血清样品1.0 mL，加入2.0 mL乙腈，涡旋5 min，12 000 r/min离心10 min，取上清液，用氮吹仪吹干后，再用100 μL 10%乙腈复溶，分别取上述溶液10 μL进UPLC-MS联用仪进行检测。

1.3.2.4方法验证

通过UPLC-MS方法分析来评估方法的精确度和准确度，准确度用相对误差(RE)来确定，计算公式：RE%=[(测定值-理论值)/理论值]×100%。E2的回收率为91.2～95.0%，相对标准偏差(RSD)为6.2～7.9%；4-OHE2回收率为109%～110%，RSD为2.6%～5.2%；2-MeOE2回收率为100%～102%，RSD为7.0～8.4%；E1回收率为97.2%～102.6%，RSD为5.6～8.1%；16α-OHE1回收率为102.4%～103.9%，RSD为7.0%～8.4%。通过绘制标准曲线，用加权直线回归法得出校准方程；在0.1～1 000 ng/mL浓度范围内拟合曲线方程。E2方程为：Y=3 847.87X+1 541.85(r=0.999 96) ；4-OHE2方程为：Y=5.618 9×104X+1.110 3×105(r=0.999 98)；2-MeOE2方程为：Y=3.457 0×104X+1.586 9×105(r=0.999 97)；E1方程为：Y=3 717.67X+28 880.01(r=0.999 94)；16α-OHE1方程为：Y=5 405.96X+15 179.68(r=0.999 98)，其中X为对照品浓度、Y为曲线下面积。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 对照组中肥胖与非肥胖组血清中雌激素及其代谢产物水平比较

在对照组绝经前妇女中，非肥胖组中E2、E1、E2/2-MeOE2、E1/16α-OHE1水平明显均低于肥胖组，差异有统计学意义(均P<0.05)，见图1。

E2、4-OHE2、E1、16α-OHE1单位均为μg/mL，其余指标无单位；a：P<0.05；b：P<0.01。

2.2 非肥胖患者雌激素及其代谢产物水平在各病理类型子宫内膜病变患者中的比较

在非肥胖绝经前妇女中，E2、4-OHE2、E1、16α-OHE1在对照组、不伴非典型性增生组、非典型性增生组表现出增高趋势，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)；两两比较发现，非典型性增生组E2、4-OHE2、E1、16α-OHE1、4-OHE2/2-MeOE2、E1/16α-OHE1均明显高于对照组及不伴非典型性增生组(P<0.05)；2-MeOE2水平在对照组、不伴非典型性增生组及非典型性增生组表现出降低趋势，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)；两两比较发现：非典型性增生组2-MeOE2、E2/E1均明显低于对照组及不伴非典型性增生组均明显高于(P<0.05)。见图2。

E2、4-OHE2、E1、16α-OHE1单位均为μg/mL，其余指标无单位；a：P<0.05；b：P<0.01。

2.3 肥胖患者雌激素及其代谢产物水平在各病理类型子宫内膜病变患者中比较

在肥胖绝经前妇女中，E2、4-OHE2、E1、16α-OHE1、E2/2-MeOE2、4-OHE2/2-MeOE2、E1/16α-OHE1在对照组、不伴非典型性增生组及非典型性增生组表现出增高趋势，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)；两两比较发现，非典型性增生组患者E2、4-OHE2、E2/2-MeOE2、4-OHE2/2-MeOE2、E1、16α-OHE1、E1/16α-OHE1均明显高于对照组及不伴非典型性增生组(P<0.05)；2-MeOE2水平在对照组、不伴非典型性增生组及非典型性增生组表现出降低趋势，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)；两两比较发现，非典型性增生组患者2-MeOE2、E2/E1在均明显低于不伴非典型性增生组及对照组(P<0.05)。见图3。

E2、4-OHE2、E1、16α-OHE1单位均为μg/mL，其余指标无单位；a：P<0.05；b：P<0.01。

2.4 子宫内膜非典型增生多因素logistics回归分析和ROC分析。

以子宫内膜非典型增生为不良结局，将雌激素及其代谢产物纳入多因素logistics回归分析，结果显示16α-OHE1是发生子宫内膜非典型增生的独立危险因素(P<0.05)，E2、4-OHE2、2-MeOE2、E1、E2/E1、E2/2-MeOE2、4-OHE2/2-MeOE2、E1/16α-OHE1与子宫内膜非典型增生的发生无明显相关性(P>0.05),见表1。16α-OHE1回归模型ROC曲线下面积(AUC)为0.897[P=0.038,95%CI(0.822,0.972)]，具有良好的诊断效能，见图4。

表1 子宫内膜非典型增生多因素logistics回归分析

图4 16α-OHE1 ROC 曲线分析

3 讨 论

子宫内膜非典型性增生为子宫内膜癌前病变的主要形式，目前认为子宫内膜非典型性增生主要与雌激素持续刺激子宫内膜组织有关[9]，但是对于雌激素代谢产物与子宫内膜非典型性增生的关系尚无研究，本研究旨在分析雌激素及其代谢产物浓度变化与子宫内膜非典型性增生发生发展的关系，准确预测子宫内膜非典型性增生的生物学标志物，并应用于临床。卵巢分泌的雌激素是绝经前女性体内雌激素的主要来源，以E2的形式作用于器官靶点，研究发现E2及其代谢产物在卵泡早期(月经干净后2～6 d)，卵泡中期(月经干净后2～16 d)，排卵期(排卵日前5 d至排卵日后5 d)，黄体中期检测值有明显的不同，因此本试验收集的是妇女月经期第2～3天的血清标本[10]。

肥胖女性体内通过子宫内膜和脂肪组织内的芳香化作用将过多的雄激素转化为可生物利用的雌激素，间接地导致子宫内膜癌的风险增加[11]。研究发现严重肥胖(BMI>30 kg/m2)使子宫内膜癌患病率增加3倍[12]。本研究通过检测绝经前的正常无子宫内膜增生病变妇女的血清标本发现，E2、E1在肥胖妇女血清中水平明显高于非肥胖妇女；这也说明了长时间的肥胖可能会增加子宫内膜病变的风险；通过检雌激素及其代谢产物可指导其健康的生活方式，减轻体重，从而预防子宫内膜病变的发生。

E2和E1通过与其受体合形成复合物，促进细胞有丝分裂及基因的突变，导致癌症的发生[13]。CYP1B1 将雌激素第4位上的碳原子羟化生成4-OHE2，且4-OHE2使大鼠患子宫内膜癌的概率是E2的9倍[14]。研究表明4-OHE2可通过磷酰化快速激活细胞外信号调节激酶/丝裂原活化蛋白激酶(ERK/MAPK)通路，导致Raf基因突变，从而可导致肿瘤的发生[14]，因此4-OHE2在诱导癌症的发生发展中起重要作用。本研究发现E2、E1、4-OHE2在非典型性增生组患者中明显高于其他组，说明4-OHE2可促进子宫内膜向非典型性增生病变的发生。

16α-OHE1是在雌激素的第16位碳原子(C-16)发生羟化反应生成的，其中CYP3A4酶在C-16羟化过程中起主要作用[15]。研究表明，16α-OHE1可与雌激素受体结合促进癌基因的表达，导致DNA的损伤和肿瘤的发生[16]。本研究发现16α-OHE1水平在子在非典型性增生组患者明显升高，说明16α-OHE1在子宫内膜发生非典型性病变过程中起促进作用。本研究在多因素logistics分析模型中发现16α-OHE1是子宫内膜发生非典型增生的高危因素，因此监测16α-OHE1水平对于子宫内膜非典型增生的诊断具有重要的价值。

2-MeOE2是内源性雌激素在第2位碳原子发生羟基化及甲基化生成的代谢产物。儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)将2-OHE2和2-OHE1转变成2-MeOE2和2-MeOE1。COMT在子宫内膜癌的细胞中过表达，降低雌激素水平，抑制肿瘤生长。本研究中，2-MeOE2在非典型性增生组明显降低，说明2-MeOE2可抑制子宫内膜非典型性增生的发生。本研究发现，E2/2-MeOE2、4-OHE2/2-MeOE2、E1/16α-OHE1在非典型性增生组明显升高，E2/E1在非典型性增生组明显降低，说明子宫内膜病变的发生与高雌激素和激素代谢的不平衡有密切关系。

本研究发现E2及其代谢产物的变化在子宫内膜病变中异常表达及监测16α-OHE1水平对于子宫内膜非典型增生的诊断具有一定的价值。本研究创新性探讨雌激素及其代谢产物在子宫内膜非典型性增生患者中表达情况，为子宫内膜非典型性增生的预防及诊断提供一个新的参考指标。在对子宫内膜非典型增生的患者保留生育功能治疗时，对E2及其代谢产物的变化的随访，可以对疾病的诊断及治疗起指导作用。对于E2及其代谢产物的异常变化给予积极治疗，可预防子宫内膜病变的发生。