蓝盆花提取物化学成分及其抗氧化活性研究

包黎明， 李淑艳， 包晓华， 拉喜那木吉拉， 奥乌力吉

(内蒙古民族大学蒙医药学院，内蒙古 通辽 028000)

蓝盆花为蒙医习用药材，习称蒙古山萝卜，蒙药名陶森-陶日木[1]。《中华人民共和国卫生部药品标准》中规定，川续断科植物窄叶蓝盆花ScabiosacomosaFisch.和华北蓝盆花ScabiosatschilliensisGurn.的干燥头状花序均为正品蒙药材蓝盆花[2-3]，主要产于内蒙古、黑龙江、吉林、辽宁等地的沙质草原，秋季开花时采摘，除去杂质，阴干，味甘、涩、性凉，具有清热、止痛作用，主要用于肺热、肝热、血热及咽喉热等[1-2]。据报道本属植物的化学成分包括黄酮类、三萜类和香豆素类等[4]。

本实验采用UPLC-Q-TOF-MSE技术对蓝盆花提取物进行了化学成分分析，采用电喷雾离子源，在负离子模式下，根据各主要色谱峰的母离子及相关碎片离子，结合对照品、文献及相关数据库进行鉴定。同时对比了蓝盆花不同溶剂提取物的体外抗氧化活性作用。

1 材料

1.1 仪器 Waters Acquity UPLC液相系统、Waters Xevo G2S TOF质谱检测器(美国Waters公司)；Varioskan LUX多功能化学发光酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；电子天平(上海光正医疗仪器有限公司)；KQ-100型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试剂 亮氨酸脑啡肽(美国Waters公司)；Folin-Ciocalteu酚试剂(北京索莱宝科技有限公司)；碳酸钠(Na2CO3)、过硫酸钾(K2S2O8)(汕头市西陇化工厂股份有限公司)；1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)、荧光素、水溶性维生素E(Trolox)、2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐(AAPH)、没食子酸、咖啡酸、绿原酸、金丝桃苷、芹菜素、芦丁(上海源叶生物科技有限公司)；奎宁酸(美国Sigma公司)。甲醇、乙腈、甲酸(质谱纯，纯度≥99.99%，美国Thermo Fisher Scientific公司)；氢氧化钠(ACS级，纯度≥97%，美国Sigma公司)；甲醇(分析纯，山东禹王实业有限公司化工分公司)；乙醇(分析纯，辽宁泉瑞试剂有限公司)；蒸馏水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)。

1.3 药材 蓝盆花花序于2020年7月采自内蒙古通辽，经内蒙古民族大学包桂花教授鉴定为川断续科蓝盆花属窄叶蓝盆花ScabiosacomosaFisch.。

2 方法

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取对照品适量，甲醇制成质量浓度为0.01 mg/mL的溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液 取干燥药材20 g，粉碎后过40目筛，加适量溶剂(150 mL)在室温下超声(100 W、40 kHz)提取3次，每次30 min，提取液合并，滤纸过滤，滤液在40 ℃旋转蒸发器中浓缩干燥。精密称取1 g，甲醇溶解后置于50 mL量瓶中，甲醇定容，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2 UPLC-Q-TOF-MSE分析条件

2.2.1 色谱 Waters Acquity BEH-C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相0.1%甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～10 min，15%B；10～25 min，15%～25%B；25～30 min，25%～40%B；30～45 min，40%～50%B；45～50 min，50%B)；体积流量0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样量2 μL。

2.2.2 质谱 ESI离子源，MSE扫描负离子模式检测；质量扫描范围m/z100～1 200；雾化气高纯度氮气，体积流量50 L/h；碰撞气氮气；脱溶剂气体积流量650 L/h，温度450 ℃；离子源温度100 ℃；锥孔电压50 V；毛细管电压2.0 kV；在MSE模式下，低碰撞能6 eV，高碰撞能15～45 eV。采用亮氨酸脑啡肽对质量进行实时校正，MassLynx V 4.1软件进行数据采集及分析。

2.3 总酚含量测定 采用福林酚法[5]，在100 μL样品溶液中加入750 μL 0.1 mol/L福林酚试剂混匀，混合物平衡5 min，加入750 μL 0.6 mol/L Na2CO3溶液混匀，静置90 min，在725 nm波长处测定吸光度。总酚含量以每1 g干燥样品提取物中的没食子酸当量表示。

2.4 抗氧化活性研究

2.4.1 对DPPH自由基的清除率 参照文献[6]报道，以抗坏血酸为对照品，将100 μL 0.1 mmol/L DPPH甲醇溶液与100 μL样品溶液(1～1 000 μg/mL) 混匀后，在黑暗中放置30 min，反应完全后采用酶标仪在517 nm波长处测定吸光度。

2.4.2 对ABTS自由基的清除率 参照文献[7]报道，取等体积ABTS溶液(7 mmol/L)与过硫酸钾水溶液(2.45 mmol/L)混合，在室温下避光反应12～16 h，甲醇稀释至在734 nm波长处吸光度为0.70±0.05，取150 μL加到96孔板中，向各孔中加入50 μL样品溶液，避光反应6 min，反应完全后用酶标仪在734 nm波长处测定吸光度。

2.4.3 氧自由基吸收能力(ORAC) 参考Huang等[8]报道的方法，以水溶性维生素E(Trolox)为对照品绘制标准曲线，以每1 g药材干重的Trolox当量表示。

3 结果

3.1 成分分析 在负离子模式下，根据母离子及碎片离子，结合对照品、相关文献及chemspider、metlin等数据库，在蓝盆花提取物中鉴定出38个化合物，基峰离子色谱图见图1，各化合物具体信息见表1。

图1 蓝盆花提取物基峰离子色谱图

3.1.1 酚酸类成分结构鉴定 化合物1、2、3的质谱裂解信息与相应对照品一致，分别鉴定为奎宁酸、绿原酸、咖啡酸。

化合物4、5、16、24在MSE扫描中均出现了m/z191的特征峰，说明它们是奎宁酸的衍生物。其中，16、24的分子离子峰分别为[M-H]-m/z515.120 6、515.121 2，MSE扫描得到碎片离子峰m/z353、191，表明结构中存在两分子咖啡酰基，为二咖啡酰喹酸异构体，再根据C18反相柱上的保留时间，分别鉴定为3，4-O-二咖啡酰基奎宁酸、4，5-O-二咖啡酰基奎宁酸[9]；4、5的分子离子峰[M-H]-分别为m/z529.156 8、367.102 0，碎片离子均出现在m/z191，根据MSE碎裂结合相关文献，分别鉴定为灰毡毛忍冬F、阿魏酰奎宁酸[10]。

3.1.2 黄酮类成分结构鉴定 通过与对照品比对，化合物11、12、17、32分别鉴定为金丝桃苷、异槲皮苷、芦丁、芹菜素。

化合物6、7、9、10、28的MSE扫描图谱中出现了[M-18]-、[M-90]-、[M-120]-碎片离子信息，提示结构里有C-糖苷键[11]，可认为是黄酮-C-糖苷类化合物。其中，6的分子离子峰[M-H]-m/z593.151 5，其碎片离子m/z473 [M-120]-、383 [M-90]-，鉴定为新西兰牡荆苷[11]；9的分子离子峰[M-H]-m/z447.093 0，碎片离子m/z429[M-18]-、357 [M-90]-、327 [M-120]-，鉴定为异荭草素[12]；7、10、28的分子离子峰分别为[M-H]-m/z461.108 6、461.107 9、461.107 0。碎片离子峰m/z371 [M-90]-、341 [M-120]-，根据MSE图谱、C18柱洗脱顺序结合相关文献，分别鉴定为香叶木素8-C-葡萄糖苷、金雀花素、日当药黄素[13]。

表1 蓝盆花提取物化学成分

化合物19的分子离子峰为[M-H]-m/z463.088 3，与11、12相同，在MSE图谱中m/z301处出现了很强的碎片离子峰，但在m/z301处出现的碎片离子峰与黄酮醇-3-O-糖苷碎裂规律不一致[14]，具有不同的取代模式，可能涉及4′位置，鉴定为绣线菊苷。

化合物8、13、14、15、21、23、27、29、35、36、38在m/z285处检测到来自山柰酚(或木犀草素)苷元的碎片离子，鉴定为山柰酚(或木犀草素)衍生物，MSE扫描图谱中山柰酚、木犀草素苷元的裂解规律不同，前者碎片离子为m/z199、175、151、133，后者为m/z255、227。其中，13、15、27的分子离子峰[M-H]-分别为m/z447.092 8、447.092 7、447.093 7，由于葡萄糖部分的丢失，在m/z285处均表现出很强的碎片离子，分别鉴定为木犀草素-4"-O-葡萄糖苷、木犀草苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷；8、14、29的分子离子峰[M-H]-分别为m/z593.150 9、593.150 0、593.131 2，碎片离子m/z285[M-H-308]-，根据MSE碎裂结合相关文献，分别鉴定为山柰酚-3-O-芸香糖苷、木犀草素-7-O-芸香糖苷、山柰酚-7-O-新橘皮糖苷[15]；21分子离子峰[M-H]-m/z579.136 7，碎片离子m/z285，是母离子丢失1分子阿拉伯糖、1分子葡萄糖形成的，MSE扫描图谱中苷元的碎片离子与木犀草素一致，鉴定为木犀草素-7-O-阿拉伯糖葡萄糖苷[16]；23分子离子峰[M-H]-m/z593.152 7，碎片离子m/z447 [M-146]-、285 [M-162]-，MSE扫描图谱中苷元的碎片离子信息与山柰酚一致，鉴定为山柰酚3-O-6-p-羟基肉桂酰基-葡萄糖苷[17]；38分子离子峰[M-H]-m/z739.167 0，碎片离子m/z593 [M-146]-、285 [M-308]-，鉴定为刺槐素。

化合物18、20、22、31在MSE高能量扫描中均出现了m/z269的碎片离子峰，鉴定为芹菜素衍生物。其中，18的分子离子峰m/z563.141 3，碎片离子m/z269，提示丢失了1分子阿拉伯糖和1分子葡萄糖，根据MSE碎裂结合相关文献，鉴定为芹菜素-7-阿拉伯糖葡萄糖苷[17]；20分子离子峰m/z431.099 2 [M-H]-，碎片离子m/z895 [2M-H]-、268 [M-162]-，鉴定为大波斯菊苷[17]。

化合物33的分子离子峰[M-H]-m/z299.054 8，碎片离子m/z284，鉴定为香叶木素[17]。

化合物37的分子离子峰m/z287.222 3，碎片离子m/z269、216、174，根据MSE碎裂结合相关文献，鉴定为黄颜木素[16]。

3.2 总酚含量测定 表2显示，不同溶剂提取物总酚含量有显著差异，最高为70%丙酮溶剂提取物，其次为70%乙醇提取物，水提物最低。

表2 蓝盆花提取物抗氧化作用及总酚含量测定结果

3.3 抗氧化活性 表2显示，70%丙酮溶剂提取物清除DPPH能力最强，其次为70%乙醇提取物，分别为抗坏血酸(IC50值4.7 μg/mL)的51.6%、33.8%；70%丙酮提取物清除ABTS能力最强，是抗坏血酸(IC50值16.2 μg/mL)的19.9%；70%丙酮提取物ORAC最高，水提物最低。

在ORAC测定中，荧光素被AAPH产生的自由基攻击时荧光会衰退，而具有抗氧化作用的样品能延迟其衰退，故抗氧化能力与能延缓荧光衰退曲线的部分面积(Net AUC)直接相关，后者即抗氧化保护面积，是指有抗氧化剂和无抗氧化剂时的荧光衰减曲线下面积之差，面积越大，抗氧化作用越强。图2显示，不同溶剂提取物均表现出很强的抗氧化能力，高于100 μmol/L水溶性维生素E，以70%丙酮提取物最强，水提物最弱。

图2 不同溶剂提取物荧光相对强度

4 讨论

蓝盆花属植物属于川断续科，我国有9种2变种。其中窄叶蓝盆花ScabiosacomosaFisch.和华北蓝盆花ScabiosatschilliensisGurn.为蒙古族习用药材，在《中华人民共和国卫生部药品标准》(蒙药分册)中规定两者均属于蒙药材蓝盆花的正品，具有清热的功能，临床多为配方应用。本研究采用UPLC-Q-TOF-MSE技术对蓝盆花花序的化学成分进行了分析，从中鉴定出38种化合物，主要成分为酚酸类及黄酮类成分。

植物中酚酸类和黄酮类化合物是主要的多酚类物质，具有抗氧化、抗炎等生理活性，而这些作用能降低肥胖、衰老、心血管疾病和神经退行性疾病的风险[18]。

对蓝盆花不同溶剂提取物进一步用DPPH、ABTS和ORAC等方法进行体外抗氧化活性实验，结果显示，蓝盆花不同溶剂提取物均显示不同程度的抗氧化活性，其中，70%丙酮提取物在3种方法测定中均显示很强的抗氧化活性。同时，总酚含量也显著高于其它溶剂提取物。综合以上结果显示，蓝盆花具有很好的抗氧化活性，其活性与总酚含量密切相关。总酚含量受萃取溶剂的影响很大，70%丙酮是提取蓝盆花酚类物质的最佳溶剂。本研究为蓝盆花的药效物质基础、质量控制及对潜在药理作用开发具有重要意义。