不同产地黑豆质量评价

李佳荣， 刘 美， 邓 莎， 葛珈铭， 李梦园， 韩翠婷， 张 坚， 马 琳，李先宽*

(1.天津中医药大学，天津 301617；2.神木市医院药剂科，陕西 榆林 719300)

黑豆是豆科植物大豆Glycinemax(L.) Merr.的干燥成熟种子，全国各地均有生产[1]，《本草纲目》[2]记载“大豆有黑、白、黄、褐、青、斑数色，黑者名乌豆，可入药及充食”。黑豆具有益精明目、养血祛风、利水、解毒之功效[3]，其煎煮取汁用于炮制何首乌、川乌、草乌、附子等多种药材，可使药物毒性降低，补益疗效增强[4-5]。由于黑豆质量对黑豆汁制中药饮片的质量、疗效、用药安全等具有重要意义[6]，故本实验对不同产地该药材质量进行评价。

1 材料

LC-20AT型液相色谱仪、Labsolution色谱数据工作站(日本岛津公司)；SB25-12DTDN型超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；H1650-w型高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；FA2104型电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)。

大豆苷、大豆苷元对照品(批号111738-201603、111502-200402，中国食品药品检定研究院)。黑豆共51批，经天津中医药大学马琳教授鉴定为豆科植物大豆Glycinemax(L.)Merr.的干燥成熟种子。甲醇、磷酸为色谱纯；水为纯蒸水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相甲醇(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脱，程序见表1；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长254 nm；进样量20 μL，色谱图见图1。

表1 梯度洗脱程序

1.大豆苷 2.大豆苷元1.daidzin 2.daidzein

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 取大豆苷、大豆苷元对照品适量，置于5 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，分别制成质量浓度为513、21 μg/mL的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液 精密称取药材粉末(过65目筛)l.0 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇20 mL，称定质量，超声处理30 min，取出，放至室温，60%甲醇补足减失的质量，摇匀，离心，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液适量，稀释至不同质量浓度，在“2.1”项色谱条件下各进样20 μL测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，得方程分别为大豆苷Y=69.69X+0.075 6(r=0.999 7)，线性范围0.75～300 μg/mL；大豆苷元Y=0.072 7X+0.01(r=0.999 9)，线性范围0.062 5～25 μg/mL。

2.3.2 精密度试验 取对照品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得大豆苷、大豆苷元峰面积RSD分别为0.24%、0.63%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性试验 取同一份供试品溶液，室温下于0、2、4、6、8、12、24 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得大豆苷、大豆苷元峰面积RSD分别为1.96%、1.47%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.4 重复性试验 取同一批样品6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得大豆苷、大豆苷元峰面积RSD分别为1.98%、2.08%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 加样回收率试验 取同一批各成分含量已知的样品6份，每份0.5 g，加入大豆苷、大豆苷元对照品适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，大豆苷、大豆苷元平均加样回收率分别为100.38%、99.70%，RSD分别为2.50%、2.33%。

2.3.6 样品含量测定 取51批样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下各进样测定3次，计算含量，结果见表2。

由此可知，大豆苷含量最高的前10批样品依次为S12>S41>S11>S27>S24>S18>S20>S13>S19>S42；大豆苷、大豆苷元总含量最高的前10批样品依次为S41>S12>S11>S27>S20>S24>S18>S19>S42>S13，而最低的4批样品为S8、S15、S36、S49，并且浸出物含量均低于12.0%。

2.4 聚类分析 将表2数据导入SPSS 21.0软件，采用组间联接法，以平方Euclidean距离为测度进行系统聚类分析，结果见图2。由此可知，各批样品聚为6类，S11～S13、S18～S20、S24、S27、S41～S42为第Ⅰ类，大豆苷含量及大豆苷、大豆苷元总含量最高，产自陕西、山西、河北、江苏、广东；S2、S6、S9、S16、S39为第Ⅱ类；S3、S10、S17、S22、S37为第Ⅲ类；S1、S4～S5、S7～S8、S14～S15、S21、S26、S29～S32、S35～S36、S38、S43～S49为第Ⅳ类；S25、S34为第Ⅴ类；S23、S28、S33、S40、S50～S51为第Ⅵ类。

图2 51批样品聚类树状图

2.5 指纹图谱建立

2.5.1 图谱生成 取“2.2.2”项下供试品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，指纹图谱(图3)以AIA格式导出，并导入“2012版中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件。采用平均数法，设置S41作为参照图谱，进行多点校正，Mark峰匹配，生成对照指纹图谱R。结果，共标定了23个共有峰，其中峰12为大豆苷，峰22为大豆苷元。

2.5.2 相似度评价 指纹图谱中非共有峰峰面积占比为10.79%～74.9%，共有峰峰面积RSD为24.26%～99.26%，表明51批样品中成分相似，但各共有成分之间的差异较大；除S15、S36、S49外，其他批次样品指纹图谱相似度均在0.90以上。

表2 各成分含量测定结果

图3 51批样品HPLC指纹图谱

3 讨论

中药炮制辅料的标准体系不够健全，黑豆尚缺炮制用辅料标准[7]。黑豆集“药辅同源”“药食同源”[8]于一身。原料来源广，各地炮制用辅料质量高低不一；成分复杂，缺乏统一指标成分标准，均为目前黑豆汁炮制药材待解决的问题[9]。近年来，科研工作者研究了黑豆汁炮制品及其生品的有效成分、毒性成分和功效变化，但针对黑豆的质量标准化研究较少，本研究从辅料源头探讨，以期完善黑豆汁辅料标准。

清代《本草述钩元》释义[10]记载：“乌豆，紧小者为雄，入药尤良”。现代研究与黑豆传统用法一致表明小粒黑豆炮制何首乌效佳[11]。“药黑豆，外黑内绿者真”，清代提及药用黑豆子叶为绿色[1]。依据孟德尔性状分离定律，子叶黄色相对绿色为显性性状[12]，优质黑豆的生态性状是自然选择的结果。大豆异黄酮是黑豆的生物活性成分，多以糖苷的形式存在，被肠道菌群分解为苷元型被人体吸收，从而发挥较高生物活性[13-15]。大豆苷和大豆苷元作为黑豆有效成分指标，大豆苷元含量越高，其炮制品药效越好[16-17]。由于大豆苷元含量在黑豆中较低，炮制过程导致部分流失[18]，初步说明黑豆中大豆苷与大豆苷元总含量越高，相应黑豆汁炮制品质量越好[19]。黑豆汁炮制药材的作用机理有待进一步探究。

通过高效液相色谱法测定51批样品中的大豆苷和大豆苷元含量，建立HPLC指纹图谱，并结合聚类分析方法较好地实现对不同来源黑豆的区分。优质黑豆皮紧粒小，黑皮黄仁，表面光滑，具光泽，一侧有淡黄白色长椭圆形种脐，质坚硬，种皮薄而脆，子叶2，肥厚，淡黄色，气微，味淡，嚼之有豆腥味，可作为黑豆质量的性状鉴别标准。优质黑豆中大豆苷含量≥0.09%，大豆苷元含量≥0.003%，浸出物含量≥17%，出粉率≥89%，主要分布在广东、陕西、河北、山西、江苏等地[11]。

综上所述，本研究建立的黑豆质量评价方法操作简便，所建立HPLC指纹图谱的色谱峰重叠率、相似度较好，可用于综合评价该药材的整体质量，并为筛选优质品提供参考依据，便于科学、合理地开发利用炮制辅料。