质谱在动物类中药研究中的应用进展

高 倩， 甘奇超， 马 晗， 史景彦， 韩 放， 魏 梅， 马 莉*

(1.首都医科大学中医药学院，北京 100069；2.重庆多普泰制药股份有限公司，重庆 401420；3.广东一方制药有限公司，广东 广州 528000)

我国动物类中药的应用历史悠久，最早的药学典籍《神农本草经》[1]中收载了僵蚕、地龙等65种，2020年版《中国药典》[2]则收载514种动物类中药、提取物及制剂。动物类中药具有攻毒散结、清热解毒、活血化瘀、补血滋阴、壮阳益肾、祛风通络、息风止痉、化痰定喘、开窍醒神等功效，富含蛋白、多肽等大分子成分[3-4]。2020年版《中国药典》中动物类中药常用的质量控制方法为显微、理化、色谱、生物检定等[2]，难以满足其质量控制需要，在定量、药效、药动学等方面也有欠缺。

质谱法在基质辅助激光场解吸电离源(MALDI)、电喷雾电离(ESI)等软电离方法的出现后，广泛应用于生物大分子领域[5]，具备灵敏度高、信息量大、检测快速等优点，现已成为蛋白质组研究的关键技术之一[6]。动物类中药中含有蛋白、多肽类成分，质谱可以对分离纯化的活性物质进行定性分析，鉴定目标蛋白、多肽，明确动物类中药的药效物质基础，明确差异蛋白，适用于动物类中药的成分鉴定、真伪鉴别、药动学等研究。本文对质谱与其在动物类中药中应用进行总结，并对质谱技术在动物类中药中的发展及前景进行展望。

1 质谱

质谱是蛋白质分析鉴定的常用技术，其通过电离源将蛋白质、多肽分子转化为气相离子，利用质量分析器将具有特定质荷比(m/z)的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的m/z值，分析鉴定未知蛋白质[7]。目前应用于蛋白、多肽分析的离子源有ESI与MALDI这2种软电离方法。ESI可以与液相色谱(HPLC)系统结合，而且因其对蛋白质分子可产生稳定的多电荷离子而不发生破裂、质荷比能够降低到各种不同类型的质量分析仪都能检测的程度的特性而被广泛应用[8]，纳升电喷雾(nanoESI)在ESI基础上提高了电离效率、离子传输能力以及灵敏度，还可以减少ESI原有的离子抑制和基质效应[9]。MALDI由于其固有的高通量、高灵敏度、耐盐性强、分析速度快、样品消耗量小、样品制备简单等特点，应用广泛，尤其在生物大分子领域[10]。ESI与MALDI离子源在蛋白、多肽分析中的特点见表1。飞行时间(TOF)、离子阱、四级杆(Q)、傅立叶变换离子回旋共振质谱(FTICR)与轨道离子阱(Orbitrap)是蛋白质、多肽质谱分析常用的质量分析器[11]。各种质量分析器常组成串联质谱，如三重四级杆质谱(QQQ)[12]，四极杆-线性离子阱-轨道离子阱(LTQ-Orbitrap)[13]质谱等，这种方法可以提高蛋白质质谱分析的灵敏度与分辨率。基于蛋白质是否经过酶解后进行质谱分析，可分为自下而上的鸟枪法和自上而下的蛋白质、多肽分析方法。鸟枪法是蛋白质、多肽分析中最常用的方法，将分离纯化得到的蛋白、多肽类物质酶解再进行质谱分析，已较为成熟；而自上而下分析方法是对完整蛋白的分析，避免了自下而上的信息丢失、数据复杂、序列覆盖等问题，但是其发展不仅依赖于昂贵的高分辨质谱仪的应用，并且实现蛋白的完整序列全覆盖难度较大，因此，在蛋白质质谱分析应用中受到限制[14]。随着技术发展，逐渐出现质谱成像技术(MSI)等新型质谱技术，基于MALDI电离方式的基质辅助激光解析电离质谱成像(MAIDI-MSI)技术在蛋白质等大分子领域应用较广，运用分子成像技术，无需标记即可实现组织切片中生物大分子的空间分布、定性、相对丰度分析。在植物鉴别[15]、代谢[16-17]等方面已有应用，在动物类中药蛋白有效成分发现与组织分布等方面有较大优势。

表1 ESI与MALDI离子源在蛋白、多肽分析中的特点

2 蛋白多肽类成分的质谱定性、定量分析技术

2.1 蛋白质定性分析技术 蛋白质的定性分析是对目标蛋白进行鉴定，常用的方法有肽质量指纹图谱法(PMF)和肽碎片离子鉴定法(PFF)。PMF是指蛋白经酶解后得到的多肽片段通过质谱技术进行分子量检测，得到具有特征性的多肽质量谱图，再通过数据库匹配进行鉴定。此方法多选用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)，能够快速准确地进行鉴定，但是此方法比较适用于较纯蛋白的检测，对于复杂的蛋白混合物，常需要与蛋白分离技术如聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)或双向凝胶电泳(2-DE)连用[18-19]。PFF是将特定的肽段打碎，得到肽段的二级质谱信息，并与数据库进行匹配，常采用MALDI串联质谱或者ESI串联质谱，但是其可能产生肽段碎裂不充分、中性片段丢失等问题[18]。定性技术已成功运用于动物类中药的成分鉴定，对动物类中药有效成分，主要成分的发现具有重大意义。

2.2 蛋白质定量分析技术 蛋白、多肽基于质谱的定量技术可分为靶向和非靶向定量技术，其依据为是否对目标蛋白进行定量，靶向定量技术可分为多反应监测(MRM)和平行反应监测(PRM)，非靶向定量技术分为非标记定量和稳定同位素标记定量[20]。非标定量有Label-free和SWATH，稳定同位素标记定量则常用的标记技术有等重同位素标记相对与绝对定量方法(iTRAQ)、同位素亲和标签技术(ICAT)和稳定同位素标记氨基酸细胞培养技术(SILAC)[21]。定量技术在动物类中药中的应用并不普遍，但在动物类中药含量检测、机制研究等方面具有较高的应用前景。各定量技术方法和特点可见表2。

3 质谱技术在动物类中药中的应用

目前，质谱技术在动物类中药的应用主要体现在成分的鉴定方面，利用质谱定性技术对动物类中药中蛋白与多肽的整体相对分子质量的水平进行分析以及对分离纯化后得到的单一成分进行结构鉴定，已成功应用于2020年版《中国药典》中胶类药物的质量控制[2]。除此以外，质谱的定性定量技术在动物类中药真伪鉴别、用药部位研究、加工工艺、药动学等方面也有应用。质谱在动物类中定性分析流程见图1。

表2 蛋白质质谱定量技术简介

图1 质谱在动物类中药中定性分析工作流程图

3.1 活性成分鉴定 动物药有效成分或主要成分不明确是目前动物药发展阻滞的主要原因，质谱定性技术为动物类中药成分鉴定提供重要的技术平台。早期研究阶段，质谱在动物类中药中主要应用于MALDI-TOF-MS对多肽、蛋白进行分子量测定，而多肽的序列测定主要是基于传统的氨基酸组成分析和Edman降解测序技术。现代研究阶段，液质连用、串联质谱技术已经逐步取代了传统的氨基酸组成分析和Edman降解测序等技术被用于一级结构的测定。

水蛭是具有抗凝、抗血栓的动物类中药，其单味药或成方制剂广泛运用于心脑血管疾病中[32]，而质谱技术在其活性多肽、蛋白鉴定过程中发挥了很大的作用。早在1998年，黄仁槐等[33]采用MALDI-TOF-MS法对从湖南产日本医蛭嗉囊消化液中经三氯醋酸沉淀后用二乙氨乙基(DEAE)-纤维素柱层析一步纯化、反相HPLC脱盐后获得批量的水蛭素进行分子量测定，测得其m/z约为8 634.61，与欧洲医蛭纯化的水蛭素分子量(6 950 Da)有所不同，推测这与材料来源不同、所提取的水蛭素分子结构存在差异有关。2006年，钟山[34]采用85%乙醇沉淀、阴离子交换色谱、凝胶过滤色谱及反相高压液相色谱对蚂蝗中抗凝多肽进行提取分离纯化，并进行氨基酸组成分析，得到一种新的抗凝多肽-蚂蝗多肽whitmanin，用MALDI-TOF-MS法测定其分子量为8 608.1 Da。2008年，贵艳丽等[35]采用仿生配体筛选和一步纯化的方法在日本医蛭中分离得到一种具有抗凝活性的蛋白，胰蛋白酶酶解后用MALDI-TOF-TOF-MS法进行氨基酸测序，未发现水蛭类相似蛋白，鉴定为一种新的抗凝蛋白并命名为NPL-1(new leech protein-1)。Huang等[36]采用亲和层析结合超高效液相色谱-高分辨质谱技术(UPLC-HR-MS)以及Orbitrap Fusion Tribrid质谱分析仪器从水蛭中鉴定得到一种新型凝血酶抑制肽，序列为SYELPDGQVITIGNER，分子量为1 790 Da。

质谱技术在其他动物类中药中也有应用，张希春等[37]经硫酸铵沉淀、超滤、阳离子交换分离和反相快速蛋白质液相色谱(FPLC)分析，得到2种新的蚯蚓抗菌肽F-1与F-2，经ESI-LC-MS/MS法测定F-1相对分子质量为535.27，肽序列为Ac-Ala-Met-Val-Ser-Ser，F-2相对分子质量为519.27，肽序列为Ac-Ala-Met-Val-Gly-Thr。Phan等[38]采用MALDI-TOF-TOF-MS法对从掘穴环爪蚓分离得到的纤溶蛋白酶FⅢ-1与FⅢ-2胰蛋白酶胶内酶解后进行多肽序列分析，得到2种纤溶蛋白酶与粉正蚓和赤子爱胜蚓具有较高的同源性。于保锋等[39-40]采用LC-MS/MS法测定前期从赤子爱胜蚓分离得到的核酸酶样蛋白EWD1和EWD2部分氨基酸的序列，经数据库搜索未发现与之匹配的蛋白，推测EWD1与EWD2为新的蛋白质成分，并采用MALDI-TOF-MS法测定这2种蛋白的含糖量和二硫键数目，为进一步研究其作用机制提供基础。严铭铭等[41]从花鹿茸中分离纯化得到单体多肽化合物(CNT14)，该化合物具有促进小鼠海马神经细胞生长的作用，通过MALDI-TOF-MS测定其分子量为1 479.902 8 Da，通过ESI-MS/MS(Q-TOF2)正交加速质谱仪测定其一级结构为EPTVLDEVCLAHGP。详见表3。

表3 质谱技术在动物类中药中活性成分的鉴定

3.2 蛋白质组学 质谱定性技术可对动物类中药整体或部位蛋白与多肽进行分析，对动物类中药的真伪鉴别、药用部位鉴别、机制研究等具有推动作用。董洪霜等[42]采用SDS-PAGE法对广地龙总蛋白进行分离并胶内酶解，用HPLC-nanoESI-LTQ-orbitrap MS法进行分析，共得到386种蛋白质，并进行功能、通路分析，为阐明广地龙的蛋白物质基础以及其功能研究提供实验依据。王浩等[43]从乌梢蛇中提取得到Ⅱ型胶原蛋白，并采用质谱技术获得乌梢蛇Ⅱ型胶原蛋白的PMF，利用数据库进行同源性分析，发现有4个多肽与其他物种具有较高的同源性。王子月等[44]采用NanoLC-LTQ-Orbitrap Velos Pro质谱仪对蟾酥鲜品胰蛋白酶酶解样品进行蛋白质组分析，共得到407种蛋白质和880种多肽序列，经过分析这些蛋白和多肽在5-羟色胺介导通路、β肾上腺素能受体通路、血凝反应、钙信号通路、胆固醇合成与代谢等76种代谢路径中发挥作用。陈霞等[45]采用NanoLC-ESI-Q-TOF MS法分别对蜈蚣裂解液的胶内酶解和溶液内酶解样品进行蛋白质分析，分别从胶内酶解样品及直接酶解样品鉴定到72、97种蛋白质，两者含26种相同的蛋白质，这些蛋白在结合、酶催化、肌动方面有生物活性。Bruand等[46]利用MALDI-MSI技术对12 d水蛭胚胎的中枢神经系统、肾脏、侧腹高表达的肽段进行定位，观察各部位高表达肽段的分子量分布与差异,同时采用LC-ESI-QTOF-MS技术鉴定肽段，结果在中枢神经系统中发现分子量为2 474 Da新肽HmIF4与分子量为2 500 Da的组蛋白H2B部分肽段，在侧腹部鉴定到相差2个氨基酸的分子量分别为3 666、3 841 Da新肽，HmIF4与在水蛭神经系统发育中的中间丝蛋白具有高度的相似度。

3.3 真伪鉴别 质谱技术可用于动物类中药真伪鉴别，特别是在胶类药物应用中尤其广泛，其主要的技术路线为寻找多种胶类药物的差异性多肽片段或者特异性多肽，从特征肽段异源框架性物种鉴别的角度对饮片或者中成药进行真伪鉴定。郑洁[47]采用MALDI-TOF-TOF-MS法对用胰蛋白酶胶内酶解后的阿胶、龟甲胶、鹿角胶以及它们原药材驴皮、龟甲、鹿角进行质谱分析，一方面运用SDS-PAGE胶内酶切后质谱分析并进行数据匹配的方法，结果从驴皮和龟甲中分别鉴定出7、1种特征蛋白，而鹿角未鉴定出特征蛋白；运用2-DE胶内酶切后进行质谱分析以及数据匹配方法，结果分别从驴皮、龟甲中鉴定出另外12、6种特征蛋白。另一方面，将阿胶、龟甲胶、鹿角胶用SDS-PAGE胶内酶切后，采用MALDI-TOF-TOF-MS法进行分析，获得3种胶类药材的指纹图谱，并分析3种中药的差异性多肽片段，为胶类中药的鉴定提供参考。郑洁[47]还将超声提取、丙酮沉淀的阿胶、龟甲胶、鹿角胶用胶原酶进行溶液内酶解，3种酶解物混合后用于UPLC-nano-ESI-Orbitrap-MS分析，共得到14条特征肽段，其中5条来源于阿胶，5条来源于龟甲胶，4条来源于鹿角胶。房芳等[48]等采用裂解液对阿胶、新阿胶(猪皮胶)、黄明胶(牛皮胶)、马皮胶进行提取后，用胰蛋白酶进行溶液内酶解，再用Nano-HPLC-QTOF-MS法对各酶解液进行分析，共鉴定得到6条特征多肽，其中阿胶和马皮胶有1条共有特征肽，序列为GEAGPAGPAGPIGPVGAR，马皮胶的特征肽序列为LSVEADIN*GLR(*表示脱酰胺修饰)和ISGEWYSIFL ASDVK，黄明胶的特征肽序列为GETGPAGPAGPIGPVGAR和GEAGPSGPAGPTGAR，新阿胶的特征肽序列为GETGPAGPAGPVGPVGAR，此研究在肽段水平上解决了阿胶中掺伪异源性物种的问题。

3.4 药用部位 动物类中药同植物药一样，不同的药用部位作用效果可能不同。鹿茸从下到上为骨片部位、血片部位和蜡片部位，其中鹿茸腊片的补益效果最强。刘华淼等[49]采用相同的方法分离纯化鹿茸腊片、血片和骨片部位蛋白，并利用2-DE结合MALDI-TOF-TOF-MS串联质谱法通过质谱相对丰度筛选差异蛋白，共得到37种差异蛋白，其中鹿茸腊片、血片、骨片组织中分别有18、5、14种蛋白质表达升高。

3.5 加工工艺 质谱技术在动物类中药炮制等加工工艺上的应用可推进炮制机理研究以及加工工艺合理性筛选。徐莹[50]通过对僵蚕生品及炮制品提取液进行SDS-PAGE与2-DE分析，结果显示，僵蚕炮制品未有明显的SDS-PAGE条带与2-DE斑点，因此徐莹[50]采用Nano-LC-ESI-LTQ-Orbitrap-MS/MS法对僵蚕生品的SDS-PAGE条带与2-DE斑点进行分析，发现有13种蛋白同时存在于SDS-PAGE条带中与2-DE斑点中，并将它们作为僵蚕炮制前后差异性蛋白，为后续的差异性毒性研究提供依据。靳梦亚等[51]采用iTRAQ技术结合NanoLC-MALDI-TOF-TOF-MS法对不同加工工艺鹿茸(鲜品、煮炸、直接冻干、匀浆、冻干加保护剂、冻干未加保护剂、冻干加保护剂40 ℃ 10 d)进行蛋白质组研究，结果表明，煮炸组、匀浆组、冻干未加保护剂组鹿茸蛋白表达降低的数量多于蛋白表达升高的数量，且煮炸组鹿茸相对于鲜品组鹿茸的差异蛋白数量最多，功能变化最大，而其他3组相对于鲜品组差异较小，蛋白表达升高的数量居多。

3.6 药动学 质谱技术也可应用于动物类中药及其制剂的药动学研究，分析药物在生物体内吸收、分布、代谢和排泄规律，推进动物类中药及其制剂应用安全性、有效性研究。张希春等[37]为了测定从蚯蚓中分离得到的蛋白水解蚓激酶的肠吸收情况，通过对原位再循环方法获得的血浆组分进行MALDI-TOF-MS分析，证实蚓激酶F1被吸收到血液中，表明蚓激酶可通过口服给药从黏膜内腔吸收到血液中。疏血通由水蛭、地龙组成，Wei等[52]通过对大鼠单次注射或连续8 d注射疏血通注射液后，进行酒石酸美托洛尔、氢氯噻嗪、硝苯地平、缬沙坦给药，并在不同的时间点收集血样，制备血浆并进行分离纯化，采用液相色谱与三重四级杆质谱联用对这4种降压药物进行MRM定量，研究疏血通注射液对4种降压药物的影响，结果显示，单次注射或连续8 d注射疏血通注射液能够增加酒石酸美托洛尔以及硝苯地平的峰值浓度(Cmax)以及生物利用度，使酒石酸美托洛尔半衰期(t1/2)延长，硝苯地平t1/2缩短，对氢氯噻嗪与缬沙坦影响不大。

4 结语

综上所述，目前质谱技术在动物类中药中应用多处于成分的定性阶段，采用PMF、PFF技术对活性蛋白、多肽成分进行鉴定已经成熟，可用于蛋白质组学分析，加工工艺、真伪鉴别、药用部位、药动学研究已有涉及，但研究并不普遍，在药效学以及作用机制研究等方面还有待推广。质谱技术主要集中在动物类中药单味药的研究，在中成药、汤剂等方面还鲜少涉及，多是对含动物类中药制剂中的植物药小分子成分进行分析，在制剂中动物类中药成分的分析还有待进一步发展。因此，有必要加深质谱技术在动物类中药应用的广度和深度，使其不局限在动物类中药单味药物的研究，在组方药物中也能更好地应用，并利用其定性、定量技术研究动物类中药作用机制，阐明作用机理，从而促进动物类中药现代化发展，更好地解决动物类中药本身药效物质基础不明确以及功效多，成分与药效难以关联的缺点。