大孔吸附树脂分离纯化益心泰总黄酮工艺的优化

邹苏兰， 李 雅， 李姿锐， 柳 兰， 陆慧玲， 郭志华

(湖南中医药大学，湖南 长沙 410208)

心血管疾病已经发展成为严重威胁人类健康的第一杀手，近年来心血管系统疾病的发病率和死亡率高居不下[1]。研究表明心脏功能与代谢有着密不可分的联系，代谢衰竭被认为在心力衰竭的发病机理中起着核心作用[2]，这与中医治疗心力衰竭的理念不谋而合。

益心泰复方是湖南中医药大学附属第一医院临床科研方，具有益气活血、利水消肿之功效，对心气亏虚、血瘀水停型心衰患者疗效确切。益心泰复方由黄芪、丹参、红花等7味中药组成，方中以黄芪为君药，补气升气，利水消肿；丹参和红花共为臣药，辅助黄芪活血通经、祛瘀止痛[3]，全方共奏益气活血、利水消肿之功效，临床用于治疗心气亏虚、血瘀水停型心衰患者。毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花苷、羟基红花黄色素A为益心泰总黄酮中主要药效成分，具有保护心血管、抗氧化、降血脂、抗肿瘤等药理作用。动物实验表明，益心泰总黄酮有效组分可以明显改善心肌梗死后心力衰竭症状、心功能、超微结构[4]。

本实验采用Plackett-Burman设计[5-6]和Box-Behnken响应面设计[7-8]，确定大孔吸附树脂分离纯化益心泰总黄酮的关键工艺参数并建立数学模型，最后通过Monte Carlo法计算获得基于概率的设计空间[9-10]，以期为益心泰总黄酮的分离纯化应用奠定基础。

1 材料

黄芪(批号19082607)、丹参(批号19050806)、红花(批号19092004)、泽泻(批号19080202)、茯苓(批号19091009)、猪苓(批号19071209)、葶苈子(批号18112505)均购于湖南新汇制药股份有限公司，经湖南中医药大学中药鉴定教研室龚力民副教授鉴定为正品，均符合2020年版《中国药典》一部附录规定。UV755B紫外可见分光光度计(上海佑科仪器仪表有限公司)；CP114电子天平(上海奥豪斯仪器有限公司)；H1850R高速离心机(湘潭湘仪仪器有限公司)。芦丁对照品(批号100080-201811，上海源叶生物科技有限公司)。色谱纯甲醇(美国Tedia公司)；优级纯甲酸；分析纯甲醇；Al(NO3)3、NaNO2、NaOH等其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 总黄酮含量测定

2.1.1 对照品溶液制备 取芦丁对照品10.50 mg，置于10 mL量瓶中，70%乙醇溶解定容至1.05 mg/mL，即得。

2.1.2 供试品溶液制备

2.1.2.1 上样液 取处方量药材(黄芪30 g、丹参15 g、红花5 g、泽泻10 g、猪苓15 g、葶苈子15 g、茯苓15 g)，第1次以10倍量70%乙醇80 ℃水浴回流提取60 min，第2次加8倍量70%乙醇80 ℃水浴回流提取30 min，滤过，合并滤液，减压浓缩后冷冻干燥，得到冻干粉。取适量至10 mL量瓶中，70%乙醇溶解定容，即得。

2.1.2.2 洗脱液 乙醇洗脱液减压浓缩后，冷冻干燥得到冻干粉，取适量至10 mL量瓶中，70%乙醇溶解定容，即得。

2.1.3 检测波长确定 取对照品溶液1.0 mL、供试品溶液2.0 mL，置于10 mL量瓶中，加入0.5 mL 5%NaNO2摇匀，静置6 min，加入0.5 mL 10%Al(NO3)3，静置6 min，加入4 mL 4%NaOH溶液摇匀，70%乙醇定容，静置10 min，在200～700 nm波长处扫描。结果，对照品、供试品溶液最大吸收波长分别为505、500 nm，故选择505 nm作为检测波长。

2.1.4 线性关系考察 取对照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL至10 mL量瓶中，加入0.5 mL 5%NaNO2，摇匀，静置6 min，加入0.5 mL 10%Al(NO3)3，静置6 min，加入4 mL 4%NaOH摇匀，70%乙醇定容，静置10 min，在505 nm波长处测定吸光度。以对照品溶液质量浓度为横坐标(X)，吸光度为纵坐标(A)进行回归，得方程为A=12.59X-0.029 6(r=0.999 1)，在0.010 0～0.060 0 mg/mL范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度试验 取对照品溶液0.5 mL，置于10 mL量瓶中，按“2.1.4”项下方法显色，在505 nm波长处测定吸光度6次，测得其RSD为0.15%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 重复性试验 平行制备6份供试品溶液，按“2.1.4”项下方法显色，在505 nm波长处测定吸光度6次，测得其RSD为1.56%，表明该方法重复性良好。

2.1.7 稳定性试验 取供试品溶液适量，按“2.1.4”项下方法显色，于0、0.5、1、1.5、3、6、12、24 h在505 nm波长处测定吸光度，测得其RSD为2.35%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.8 加样回收率试验 取各成分含量已知的供试品溶液9份，每份1 mL，精密加入80%、100%、120%对照品溶液，按“2.1.4”项下方法显色，在505 nm波长处测定吸光度，计算回收率。结果，芦丁平均加样回收率分别为99.63%、98.89%、99.45%，RSD分别为2.01%、1.03%、1.13%。

2.2 上样液制备 取冻干粉5.00 g至500 mL量瓶中，70%乙醇溶解定容，制得10 mg/mL供试品溶液，取0.5 mL，加入0.5 mL 5%NaNO2，摇匀，静置6 min，加入0.5 mL 10%Al(NO3)3，静置6 min，加入4 mL 4%NaOH摇匀，70%乙醇定容，静置10 min，在505 nm波长处测定吸光度，测得总黄酮质量分数为9.08%。

2.3 树脂筛选 MAR吸附分离技术是在中药有效成分的精制分离和复方中药制剂的纯化中常用的提取纯化工艺，它是通过静态吸附作用从中药及其复方提取液中有选择性地吸附其中的有效部分，去除无效部分[11-12]，在理化性质、选择性、吸附能力等方面有着无可取代的优势，并且易洗脱、可循环使用[13-14]，同时其种类多，在结构、极性、孔径等性能指标上均有所差异。D-101型大孔吸附树脂是一种非极性吸附剂，比表面积为400 m2/g，适合极性或弱极性化合物(皂苷类、黄酮类)分离纯化[15]；AB-8型为一种弱极性的大孔吸附树脂，比表面积为480～520 m2/g，王春民等[16]报道，它对黄芩总黄酮的效果最好；HPD-100型大孔吸附树脂是苯乙烯型非极性共聚体，适用范围广，可用于皂苷、黄酮、萜类等天然产物及植物的提取分离；易海燕等[17]发现，它对藤茶总黄酮的吸附效果最佳。因此，本实验选择对黄酮吸附性强、解吸性好的AB-8、D-101、HPD-100大孔吸附树脂，进行单因素试验。

2.3.1 树脂预处理与再生

2.3.1.1 预处理 将AB-8、D101、HPD-100大孔吸附树脂用无水乙醇浸泡24 h以充分溶胀后，95%乙醇冲洗，至洗出液加5倍量蒸馏水时无白色浑浊，蒸馏水洗至无醇味，密封保存，备用。

2.3.1.2 再生 将使用过的树脂用无水乙醇洗脱至无色后，5%盐酸浸泡3～4 h，水洗至中性，5%NaOH浸泡3～4 h，水洗至中性。

2.3.2 静态吸附性能考察 准确称取经预处理好的3种树脂(相当于干树脂2.00 g)，置于100 mL具塞锥形瓶中，分别精密加入质量浓度为0.911 2 mg/mL上样液30 mL，室温振摇吸附，于1、2、4、6、10、24 h吸取上清液，测定吸光度，计算静态吸附量和吸附率，公式分别为吸附量=(上样液中总黄酮质量浓度×样液体积-水洗液中总黄酮质量浓度×水洗液体积)/树脂质量、吸附率=[(上样液中总黄酮质量浓度×样液体积-水洗液中总黄酮质量浓度×水洗液体积)/上样液中总黄酮质量浓度×样液体积]×100%，结果见表1～2。由此可知，3种树脂静态吸附10 h后均基本达到饱和，其中HPD-100吸附量最大，吸附率最高。

表1 树脂静态吸附量测定结果

表2 树脂静态吸附率测定结果

2.3.3 静态解吸性能考察 准确称取经预处理好的3种树脂(相当于干树脂2.00 g)，置于100 mL具塞锥形瓶中，精密加入0.911 2 mg/mL上样液30 mL，室温振摇吸附24 h，精密加入50%、70%、90%乙醇各40 mL，充分振摇6 h后静置24 h，收集乙醇洗脱液，按“2.1.4”项下方法显色，测定吸光度，计算解吸量和解吸率，公式分别为解吸量=醇洗液中总黄酮质量浓度×醇洗液体积/树脂质量、解吸率=[醇洗液中总黄酮质量浓度×醇洗液体积/(上样液中总黄酮质量浓度×样液体积-水洗液中总黄酮质量浓度×水洗液体积)]×100%，结果见表3。由此可知，HPD-100树脂静态吸附能力最强。

表3 树脂静态解吸量及解吸率测定结果

2.4 评价指标确定 本实验选择总黄酮质量分数和总黄酮洗脱率作为评价指标，公式分别为总黄酮质量分数=洗脱液中黄酮质量/洗脱液干物质质量、总黄酮洗脱率=(洗脱液中黄酮质量/上柱液黄酮质量)×100%。

2.5 Plackett-Burman设计 总黄酮分离纯化工艺鱼骨图见图1，可知主要涉及药材、环境、树脂、吸附、解吸、除杂。由于本实验处于同一实验环境，采用同一批药材提取，故不考虑环境和药材因素，另外树脂因素在单因素试验中已进行考察，最终选择上样液体积(A)、水洗体积流量(B)、上样液体积流量(C)、乙醇洗脱量(D)、乙醇体积分数(E)、乙醇洗脱流量(F)、水洗体积(G)进行Plackett-Burman设计，确定关键工艺参数(CPPs)，共12组实验，因素水平见表4，通过Minitab软件进行数据处理，结果见表5，方差分析见表6～7。

图1 总黄酮分离纯化工艺鱼骨图

表4 Plackett-Burman设计因素水平

由表6可知，上样液体积流量(C)、乙醇体积分数(E)、水洗体积(G)对总黄酮质量分数有显著影响(P<0.05)；由表7可知，上样液体积(A)、水洗体积(G)对总黄酮洗脱率有显著影响。因此，选择因素A、C、E、G作Box-Behnken响应面设计。

2.6 Box-Behnken响应面设计 在Plackett-Burman设计结果基础上，选择上样液体积(A)、上样液体积流量(B)、水洗体积(C)、乙醇体积分数(D)作为影响因素，总黄酮质量分数(Y1)、洗脱率(Y2)作为评价指标，Box-Behnken响应面设计优化分离纯化工艺，因素水平见表8，结果见表9。

表5 Plackett-Burman设计结果

表6 Plackett-Burman设计总黄酮质量分数方差分析

表7 Plackett-Burman设计总黄酮洗脱率方差分析

表8 Box-Behnken响应面设计因素水平

表9 Box-Behnken响应面设计结果

总黄酮质量分数方差分析见表10，可知模型P<0.000 1，达到极显著水平；失拟项P>0.05，表示方程拟合度良好；因素A、B、AB、BC、BD有显著影响(P<0.05)。响应面分析见图2。

图2 总黄酮质量分数各因素响应面图

总黄酮洗脱率方差分析见表11，可知模型P<0.05，达到极显著水平；失拟项P>0.05，表明方程拟合度良好；因素A、B、C、AD、BC、C2、D2有显著影响(P<0.05)，响应面分析见图3。

图3 总黄酮洗脱率各因素响应面图

2.7 设计空间建立 根据Design-Expert 10.0软件得到的2个数学模型开发设计空间，通过查阅文献和近年来相关管理办法，希望大孔吸附树脂分离纯化的总黄酮质量分数、洗脱率均大于50%，故设置两者优化标准为50%，目标范围为大于50%。采用Monte Carlo法获取基于达标概率的设计空间，首先进行仿真模拟实验，获得实验测定误差来计算达标概率，以总黄酮质量分数、洗脱率同时满足优化标准为其达标，模拟次数设置为5 000次，假定所有的检测量服从正态分布，均值取单组实验的检测量，目标正态分布的标准差取相同条件重复实验所得检测量的标准差，再采用实验穷举法对每个工艺参数进行穷举，步长取0.05得到的设计空间见图4。最终确定，最优操作空间为上样液体积3 BV，乙醇体积分数75%，水洗体积3.0～4.8 BV，上样液体积流量1.3～2.0 BV/h。

表10 Box-Behnken响应面设计总黄酮质量分数方差分析

表11 Box-Behnken响应面设计总黄酮洗脱率方差分析

对设计空间进行3批验证试验，结果见表12。由此可知，当相关参数落在设计空间内时，可保证总黄酮分离纯化工艺的稳定性，对指导实际生产过程具有重大参考意义，符合质量源于设计(QbD)理念。

表12 验证试验结果

3 讨论

相较于传统的单因素实验，Plackett-Burman设计是一种两水平的试验设计方法，它可以用最少试验次数筛选并确定对结果影响比较显著的因素，对于受多种因素影响的实验来说，它可以科学客观地筛选出显著性的因素，可以避免不必要的资源浪费[18]。Box-Behnken响应面分析法能够在因素和响应值之间建立模型，不仅仅可以通过相关数据进行拟合，筛选出最佳工艺，而且对实验的预测性较好，信息量大，精确度高[19]。人用药品注册技术标准国际协调会(ICH)Q8是将QbD定义为一套系统的基于充分的科学知识和质量风险管理的研究方法，从预先确定的目标出发，强调对产品工艺的理解以及工艺控制。

注：图中数字为工艺参数落在相应区域时关键评价指标未能达标的概率，数字越大，不达标可能性越大；绿色区域为设计空间，颜色由绿到红表示在相应工艺条件下，响应值不符合要求的概率逐渐增大。

本研究采用Plackett-Burman设计筛选出样液体积、上样液体积流量、水洗体积及乙醇体积分数为大孔吸附树脂分离纯化益心泰总黄酮工艺中的CPPs；结合Box-Behnken设计建立了大孔吸附树脂分离纯化益心泰总黄酮的CPPs与关键评价指标的数学模型，最后通过Monte Carlo法计算获得基于概率的设计空间，最终得到的推荐的工艺参数的操作空间为上样液体积3.5～4.0 BV，水洗体积3～3.2 BV，上样液体积流量1.8～2.0 BV/h。基于QbD理念的总黄酮分离纯化的设计空间，是通过了解和控制关键工艺参数，确保产品质量，使分离纯化工艺在研发阶段获得了充分的工艺知识，质量属性和工艺参数可靠，分离纯化工艺流程始终能在保证益心泰总黄酮质量的范围内运行，可以最大限度减少失败的成本，保证总黄酮质量分数及总黄酮洗脱率都能达到有效分离纯化的条件。