绿原酸对H2O2致小鼠RGC-5细胞损伤的保护作用

姜 逸， 胡 娜， 袁 琳， 林 敏， 钟霄毓， 陆 敏， 陆 雄

(上海中医药大学科技实验中心，上海 201204)

糖尿病视网膜病变是糖尿病患者最常见的并发症[1]，也是可预防性视力障碍和失明的主要原因之一[2]，其病变成因复杂，微血管病变长期被认为是其核心病理机制[3]。研究证实，糖尿病视网膜神经变性是糖尿病视网膜病变的早期事件，早在微血管病变之前神经节细胞层就已经出现了结构性与功能性的改变，如视网膜神经节细胞数减少、神经纤维层变薄和电生理异常等[4-5]。此外糖尿病患者机体持续的高血糖状态会导致细胞代谢失衡，引发葡萄糖氧化过多、ROS产生、细胞凋亡等。视网膜神经组织需要较多能量以维持神经细胞膜极化，而这种特性使得其极易受到氧化应激的影响[6-7]。在生理或病理条件下自噬能促进受损的细胞器更新，分解代谢产物重回物质循环，引导细胞作出双向适应性应答[8-9]。因此，越来越多有关糖尿病视网膜病变致病机理和药物有效性的研究靶向自噬在氧化应激条件下的作用。

绿原酸是金银花、杜仲、野菊花等多种中药的活性成分，现代药理研究发现其通过降低ROS水平，上调抗氧化酶活性进而降低或阻止氧化应激的发生，具有较强的抗氧化作用[10-11]，但其是否具有保护视网膜神经节细胞的作用尚不明确。本实验采用H2O2体外间接模拟高血糖诱导的氧化应激环境，探究绿原酸对小鼠视网膜神经节细胞系RGC-5的作用。

1 材料

1.1 细胞 小鼠视网膜神经节细胞(RGC-5，上海富衡生物科技有限公司，货号FH0369)。

1.2 试剂与药物 绿原酸(HPLC≥98%，大连美伦生物技术有限公司，货号J0120AS)。3% H2O2、MTT(美国Sigma公司，货号88597、MKCD4805)；DMEM高糖培养基、细胞培养级PBS(大连美仑生物技术有限公司，货号MB4372、MA0016)；0.25%Trypsin-EDTA、胎牛血清(美国Gibco公司，货号1869505、2045677RP)；DMSO[生工生物工程(上海)股份有限公司，货号BB02BA001]；LC3抗体、p62抗体、β-actin抗体、辣根过氧化酶(HRP)标记的IgG抗体(美国CST公司，货号12741、23214、5125、7074)；RIPA裂解液、SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、ECL特超敏化学发光试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，货号P0013C、P0012AC、P0015L、P0018AS)；BCA蛋白定量试剂盒(上海雅酶生物科技有限公司，货号ZJ101)；0.45 μm PVDF膜(德国Merck公司，货号R7SA6402D)；蛋白Marker(美国Thermo Fisher公司，批号00451236)。锇酸(美国Alfa Aesar公司，批号10108150);十二烷基琥珀酸酐(DDSA，美国Polysciences公司，批号82714)；环氧树脂E-51(618#)(昆山绿循电子材料有限公司)；DMP-30(美国SPI公司，批号1101122)；邻苯二甲酸二丁酯、丙酮、乙醇(国药集团化学试剂有限公司，批号20160526、20200811、20210728)；醋酸铀(美国Electron Microscopy Sciences公司，批号180926-01)。

1.3 仪器 NU-5510E培养箱(美国Nuair公司)；Alpha Clean1300超净台[力康精密科技(上海)有限公司]；Spectra Max190酶标仪(美国Molecular Devices公司)；Tecnai G2 spirit透射电子显微镜(美国FEI 公司)；705902超薄切片机(德国Leica公司)；AI 600超灵敏多功能成像仪(美国GE公司)。

2 方法

2.1 细胞培养、造模及给药 RGC-5细胞使用含10%胎牛血清的DMEM培养基，日常培养于37 ℃、5%CO2、相对湿度95%的细胞培养箱中。细胞分为正常组、模型组和绿原酸组，细胞接种后培养24 h；正常组更换正常培养基继续培养，模型组和绿原酸组更换含H2O2(终浓度为30 μmol/L)培养基造模，继续培养24 h；吸弃原培养基，正常组和模型组更换正常培养基，绿原酸组加入相应浓度含绿原酸(6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L)的培养基，继续培养12 h，结束后收集细胞进行后续检测。

2.2 MTT法检测RGC-5细胞存活率 将RGC-5细胞以5×104/mL的密度接种于96孔板，每孔100 μL，每组设6个复孔，按“2.1”项下方法造模、给药，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，培养箱继续孵育4 h，吸弃孔内液体，每孔加入150 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min使甲瓒结晶物完全溶解，使用酶联免疫检测仪在490 nm波长处检测各孔光密度(OD)值，并计算细胞存活率。

2.3 免疫荧光染色观察RGC-5细胞数 RGC-5细胞按“2.2”项下方法培养、造模、给药后，4%多聚甲醛固定细胞30 min，加入免疫染色强力通透液，室温孵育5 min，PBS清洗后用Hochest(10 μg/mL)染核10 min，PBS清洗后于1 h内进行观察，并记录细胞数。

2.4 透射电子显微镜观察RGC-5细胞超微结构 RGC-5细胞按“2.1”项下方法造模、给药后，收集细胞沉淀至绿豆大小，2.5%戊二醛4 ℃前固定2 h，2.5%锇酸4 ℃后固定2 h，梯度乙醇、丙酮脱水后转移样本至环氧树脂包埋剂中固化烘干，随后超薄切片80 nm，柠檬酸铅染色后使用透射电子显微镜观察细胞超微结构。

2.5 Western blot检测RGC-5细胞LC3、p62蛋白表达 将RGC-5细胞以8×104/mL的密度接种于6孔板，每孔2 mL，每组设3个复孔，按“2.1”项下方法造模、给药后，收集细胞沉淀，加入RIPA裂解液，冰浴超声裂解提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。采用SDS-PAGE凝胶电泳分离等量蛋白样本，随后转移至PVDF膜上，用含有5%脱脂奶粉的TBST封闭2 h，加入一抗在4 ℃条件下孵育过夜，TBST清洗后，加入二抗在室温下孵育1 h，滴加ECL化学发光试剂，成像仪成像后用Image J软件分析条带灰度值，以β-actin为内参计算目的蛋白相对表达。

3 结果

3.1 绿原酸对H2O2损伤的RGC-5细胞活性的影响 如表1所示，绿原酸浓度大于25 μmol/L时，可剂量依赖性地增加RGC-5细胞存活率(P<0.05，P<0.01)，在100 μmol/L时达到峰值，随后趋于平稳。本实验采用30 μmol/L H2O2进行造模，如表2所示，与正常组比较，模型组细胞存活率降低(P<0.01)；与模型组比较，绿原酸组细胞存活率增加，其趋势与不造模时相同，且100 μmol/L时作用最为明显(P<0.01)。

表1 绿原酸对RGC-5细胞存活率的影响

表2 绿原酸对H2O2损伤的RGC-5细胞存活率的影响

3.2 绿原酸对H2O2损伤的RGC-5细胞数的影响 如图1、表3所示，与正常组比较，模型组细胞数减少(P<0.01)；与模型组比较，绿原酸100 μmol/L组细胞数增加(P<0.01)。

表3 绿原酸对H2O2损伤的RGC-5细胞数的影响

图1 RGC-5细胞Hochest染色(明场与荧光合成伪彩图，×200)

注：M为线粒体，ER为内质网。实心箭头指示肿胀的线粒体，空心箭头指示肿胀的内质网，方框内为自噬泡。

3.3 绿原酸对RGC-5细胞超微结构的影响 如图2所示，正常组RGC-5细胞器丰富，偶见自噬小泡，未见其他异常；模型组RGC-5细胞呈现大量内质网和线粒体肿胀，未见自噬泡形成；绿原酸给药组自噬泡形成，且数量增多。

3.4 绿原酸对RGC-5细胞自噬相关蛋白表达的影响 如图3所示，与正常组比较，模型组细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达比值降低(P<0.01)，p62蛋白表达升高(P<0.05)；与模型组比较，绿原酸各浓度组LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达比值呈剂量依赖性升高(P<0.01)，p62蛋白表达呈剂量依赖性降低(P<0.01)。

注：与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01。

4 讨论

糖尿病视网膜病变的发生是一个复杂的病理过程，高血糖始终是糖尿病视网膜病变发病机制中最重要的起始因素。研究表明，细胞持续处于高血糖状态容易导致氧化应激，而视网膜需氧量大、葡萄糖氧化性强更易遭受氧化应激的攻击，最终诱发高代谢需求的视网膜神经节细胞凋亡[12]。既往临床着重于糖尿病视网膜病变后期增生性阶段的微血管病变，但其标准疗法——激光光凝术临床不良反应较多，另一些治疗方法如玻璃体内注射VEGF抗体及一些类固醇药物的效果也不尽人意[13-14]。而中医药疗法历史悠久、价格低廉、副作用小，在防治糖尿病视网膜病变方面具有突出优势[15-16]。因此，本研究对绿原酸的抗氧化能力是否发挥保护视网膜神经节细胞的作用进行了探索。

自噬是真核细胞特有的利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的生命现象[17]。在正常生理条件下，自噬普遍低水平表达，在细胞生长、发育过程中发挥着重要作用，并有助于维持细胞产物的合成与分解代谢过程之间的平衡[18]。当机体面临营养匮乏、氧化应激、内质网应激、细胞因子或病原微生物等广泛的内外压力时，自噬可以引导细胞做出双向适应性应答，决定细胞生存或死亡[8,19]。Gonçalves等[20]发现自噬缺陷与神经退行性疾病中的神经元丢失有关，自噬保护神经元免受脱髓鞘和营养匮乏的影响。Li等[21]发现自噬在高葡萄糖引起的神经毒性中起着保护作用。更有研究证实，自噬可以清除氧化应激条件下受损的蛋白质分子及细胞器，维持机体新陈代谢过程以保证衰老和受损细胞器的生理循环。当自噬受阻时，异常的蛋白质及细胞器聚集，进一步加剧氧化应激导致细胞死亡[22]。本实验结果显示，H2O2刺激后RGC-5细胞存活率降低，细胞数减少，线粒体和内质网肿胀；绿原酸在一定浓度范围内呈剂量依赖性地恢复细胞活性，100 μmol/L剂量最佳，且用药后细胞内出现较多自噬泡。

自噬形成时，胞浆型LC3(即LC3Ⅰ)会酶解掉一段多肽，转变为(自噬体)膜型(即LC3Ⅱ)，LC3Ⅱ是自噬泡膜形成的关键组分，因此LC3Ⅱ/Ⅰ比值的大小可评估自噬水平的高低[23]。而p62蛋白作为受体蛋白可以结合异常的蛋白成分与LC3相互作用最终被自噬体识别降解。自噬上游表达增强或者下游降解阻断，都会导致p62的聚集[23]。本研究结果显示，模型组细胞LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达比值降低，绿原酸呈剂量依赖性地上调LC3Ⅱ蛋白表达。而与正常组比较，模型组p62蛋白表达增加；与模型组比较，绿原酸给药组p62蛋白表达呈剂量依赖性地降低。结果提示，H2O2刺激模拟的氧化应激使线粒体、内质网肿胀破坏，异常的细胞器负载，可能阻断下游自噬降解途径，而绿原酸可能通过恢复自噬过程，促使自噬泡形成而发挥保护RGC-5细胞的作用。

综上所述，绿原酸可以通过调控自噬相关蛋白保护H2O2损伤的小鼠RGC-5细胞，为揭示绿原酸治疗糖尿病视网膜病变早期的神经退行性病变的复杂机制提供参考。