黄精多糖对RAW 264.7细胞活性及炎症因子TNF-α、IL-6、iNOS表达的影响

杜 青， 陈 林*， 贺 炜， 劳 嘉， 蔡 媛， 黄建华

(1.湖南省中医药研究院中药研究所，湖南 长沙 410013；2.绿之韵生物工程集团有限公司，湖南 长沙 410329)

黄精Polygonatumsibiricum是多年生黄精属百合科的一种药食同源草本植物，主要以根茎入药，具有补中益气、滋润心肺、强壮筋骨等功效[1]。黄精中含有多种化学成分，包括多糖、黄酮、皂苷、生物碱、氨基酸、木质素、挥发油等，其中，黄精多糖是其主要活性成分之一，含量约占14%[2]。现代药理研究发现，黄精多糖具有降血糖、抗氧化、肝保护、抗肿瘤、提升免疫等多种作用[3]。无论是药物还是保健食品研究领域，多糖的免疫调节作用一直是研究的热点之一，常被用作免疫调节剂。目前，关于黄精多糖对机体的免疫提升作用及机制至今尚未明确。巨噬细胞是机体重要的固有免疫细胞，具有抗原呈递性，无论是在先天免疫应答还是在适用性免疫中都起着非常重要的作用，是机体抵御外界抗原入侵的第一道防线[4]。巨噬细胞表面存在多种受体，可与植物多糖结合后活化，并分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和一氧化氮(NO)等细胞因子，以抵御外来刺激，发挥免疫调节作用[5]。本研究主要针对黄精多糖对小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7的免疫活性调节作用及机制，为黄精资源的高效利用及黄精多糖的产品开发和利用提供一定理论基础。

1 材料

1.1 细胞 RAW264.7细胞株，购自中国科学院上海细胞库。

1.2 药物 黄精购自湖南省中医药研究院附属医院，准确称取黄精样品粉末(过3号筛)，先用石油醚除去色素等杂质后烘干，按料液比1∶15加入纯水，于90 ℃水浴锅中加热回流1 h，提取2次，离心得到提取液，合并2次提取液，加入无水乙醇至终体积分数80%，摇匀后静置12 h，离心收集沉淀，经冷冻干燥得到黄精粗多糖，进一步采用sevage法去除蛋白，得到纯化的多糖。经过分析测定，总糖含量为82.3%。

1.3 试剂 DMEM高糖培养基、FBS(美国Gibco公司，批号8119002、42F0266K)；LPS(美国Sigma公司，批号C59M4173V)，CCK8、TNF-α一抗、IL-6一抗、iNOS一抗(北京博奥森生物技术有限公司，批号A10801411T、A101286265、A107319225、A101177400)；NO、TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号20190816)；FITC标记二抗(武汉三鹰生物技术有限公司，批号SA00003-2)。

1.4 仪器 XDS-3型倒置显微镜(广州粤显光学仪器有限责任公司)；HERACe型CO2细胞培养箱(美国Thermo公司)；Enspire型多功能酶标仪、OPERETTA型高内涵细胞成像分析系统(美国Perkinelmer公司)；LSM800型激光共聚焦显微镜(德国蔡司公司)。

2 方法

2.1 细胞培养 RAW 264.7细胞采用DMEM高糖培养基(其中含10%FBS和1%双抗)于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养，每隔2～3 d换液1次，并以1∶3比例传代培养。

2.2 CCK8法检测细胞活力 待RAW 264.7细胞生长至70%～80%融合程度时，用0.25%胰蛋白酶消化，调整细胞密度至5×103/mL，接种于96孔板中，培养18 h，设置31.25、62.5、125、250、500 μg/mL 5个质量浓度黄精多糖组，另设正常组，每组4个复孔。待细胞充分贴壁后，弃掉孔内液体，正常组加入200 μL培养液，给药组加入200 μL含相应质量浓度药物的培养液，继续培养24 h，弃掉孔内液体，每孔加入完全培养基180 μL和CCK8溶液20 μL，继续培养3 h，用酶标仪于450 nm波长处检测各孔光密度(OD)值，以正常组为对照，计算各组细胞的相对存活率。

2.3 细胞分组、给药及形态学观察 取对数期生长的RAW 264.7细胞，以5×103/mL密度接种于96孔板中，培养18 h，随机分成正常组，LPS(1.0 μg/mL)组，黄精多糖250、62.5 μg/mL组，每组设置3个复孔，正常组加入200 μL培养液，其余各组加入200 μL含相应质量浓度药物的培养液，继续培养24 h，观察各组细胞形态结构变化。

2.4 ELISA法检测细胞上清液中TNF-α、IL-6、NO水平 收集各组细胞上清液，3 000 r/min离心15 min，取上清液，参照TNF-α、IL-6、NO ELISA试剂盒说明书，检测各组细胞上清液中TNF-α、IL-6、NO水平。

2.5 HAC法检测TNF-α、IL-6、iNOS蛋白表达 各组细胞培养24 h后，4%多聚甲醛固定45 min，0.25% Triton-100处理15 min，5% BSA封闭15 min，分别加入兔抗小鼠iNOS、TNF-α、IL-6一抗稀释液(1∶100～1∶200)，4 ℃避光孵育过夜，加入FITC标记的山羊抗兔稀释液(1∶400)，37 ℃避光孵育30 min，加入DAPI稀释液，室温避光孵育15 min，最后使用高内涵成像系统进行荧光检测并拍照，并以细胞平均荧光强度值反映各蛋白相对表达。

2.6 RT-qPCR法检测TNF-α、IL-6、iNOSmRNA表达 将RAW 264.7细胞接种于6孔细胞培养板，静置培养18～24 h，按“2.3”项下方法进行分组、给药，培养24 h，弃掉孔内液体，PBS洗2次，加入TRIzol试剂4 ℃处理60 min，然后转移至EP管中进行总RNA的抽提，并以总mRNA为模板逆转录合成cDNA，进行real-time PCR检测，实验结果采用2-ΔΔCT法，以β-actin为内参，计算目的基因(iNOS、TNF-α、IL-6)相对表达。引物序列见表1[6]。

表1 引物序列

3 结果

3.1 黄精多糖对RAW 264.7细胞活力的影响 与正常组比较，随着黄精多糖质量浓度的增加，细胞活性先升高后降低，在62.5 μg/mL时最高(P<0.01)，而500 μg/mL黄精多糖则抑制细胞生长(P<0.01)。因此，本实验选择质量浓度31.25～200 μg/mL范围内的剂量进行后续研究，见图1。

注：与正常组比较，**P<0.01。

3.2 黄精多糖对RAW 264.7细胞形态的影响 与正常组比较，黄精多糖62.5、250 μg/mL组和LPS组巨噬细胞由类圆形变成激活态的不规则梭形或多角形，见图2。

图2 RAW 264.7细胞形态的变化(×100)

3.3 黄精多糖对RAW 264.7细胞TNF-α、IL-6、NO分泌的影响 与正常组比较，黄精多糖62.5、250 μg/mL组和LPS组细胞上清液中NO、TNF-α、IL-6水平均升高(P<0.05，P<0.01)，其中尤以250 μg/mL黄精多糖及LPS组作用最为显著，提示黄精多糖能不同程度刺激免疫炎症因子释放，见图3。

3.4 黄精多糖对RAW 264.7细胞TNF-α、IL-6、iNOS蛋白表达的影响 与正常组比较，黄精多糖62.5、250 μg/mL组和LPS组细胞内TNF-α、IL-6、iNOS蛋白荧光强度增强(P<0.05，P<0.01)，其中尤以黄精多糖250 μg/mL组增加最为明显，提示黄精多糖能刺激炎症因子相关蛋白TNF-α、IL-6、iNOS表达增加，见图4。

3.5 黄精多糖对RAW 264.7细胞TNF-α、IL-6、iNOSmRNA表达的影响 与正常组比较，黄精多糖上调了细胞中TNF-α、IL-6、iNOSmRNA表达(P<0.05)，与LPS作用相当，且呈剂量依赖性，在黄精多糖质量浓度为250 μg/mL时表达较高，提示黄精多糖刺激在转录水平上增强了促炎细胞因子TNF-α、IL-6、iNOS的表达，见图5。

注：TNF-α和IL-6水平单位为ng/L，NO水平单位为μmol/L。与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01。

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01。

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01。

4 讨论

免疫调节对于维持机体内环境稳定起着关键作用，RAW264.7细胞是小鼠腹腔巨噬细胞系，是常用的研究免疫功能的细胞模型之一。活化的巨噬细胞不仅能够吞噬病原体，还能分泌调节免疫反应的细胞信使。多糖因其分子量、单糖组成和糖苷键等结构可与巨噬细胞上的甘露醇受体结合并导致免疫活化，释放细胞因子等免疫活性物质，从而提高机体的免疫功能[7]。具有免疫调节活性的多糖可促使RAW264.7细胞形态改变，主要表现为体积增大、伪足生长等[8]。细胞的形态可以直接反应出细胞的活力，本研究通过CCK8法筛选得黄精多糖促进RAW264.7细胞活力增强的最佳剂量，并采用显微镜观察细胞表现为活化状态，表明黄精多糖具有潜在的免疫调节活性。

细胞因子主要由免疫细胞等分泌的一类小分子可溶性多肽蛋白，并通过与相应受体结合调节细胞生长分化，调控免疫应答。有研究发现，黄精多糖处理可以增强小鼠的免疫功能，提高RAW264.7巨噬细胞的吞噬作用，并增加IL-2、TNF-α、IL-8和IL-10等细胞因子水平[9]。TNF-α是巨噬细胞活化时释放的重要细胞因子，能发挥促进T细胞增殖和激活树突状细胞成熟的作用，在宿主防御系统中起着关键作用，并可以诱导许多其他免疫调节[10]，还可以促进感染部位的趋化因子及白细胞介素的分泌[11]，诱导白细胞在感染部位的聚集并起到对被感染部位病原微生物进行清除的作用。IL-6是白细胞介素家族中的一员，可促进细胞的吞噬和粘附作用，是巨噬细胞发挥免疫功能的重要生物活性细胞因子，TNF-α的大量分泌可刺激IL-6的产生，调控T细胞的活化、B细胞的分化及淋巴细胞的分型，发挥非特异性免疫调节作用[12-13]。TNF-α还可与iNOS基因上游启动子反应元件结合，引发iNOS基因的转录，从而诱导细胞产生大量NO[14]。NO是一种简单但却不稳定的自由基，由一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸产生，是机体免疫系统的效应器，可参与杀死病原微生物[15]。NO分泌量的增加，可促使巨噬细胞吞噬能力增强，机体抗病能力随之增强[16]。这些生物活性因子进一步作用于淋巴细胞、成纤维细胞等，在天然免疫防御和获得性免疫应答中起着不可忽视的作用。

黄精作为补益类中药在提高机体免疫功能方面发挥着独特的疗效，本研究发现，黄精多糖可以增加RAW264.7巨噬细胞上清液中TNF-α、IL-6和NO分泌与表达，并且与LPS阳性对照相近，且黄精多糖在质量浓度为250 μg/mL时不会影响正常巨噬细胞的活力，并表现出较强的免疫调节活性，能够激活RAW264.7巨噬细胞，并诱导细胞因子的产生，从而增加机体非特异性免疫。黄精多糖有望成为免疫应答的调节剂，其开发和应用对于预防及提高机体免疫力低下具有重要意义。