小儿肺咳颗粒中鳖甲DNA分子鉴定

苏 园， 王立玮， 焦兆群， 徐 超， 夏国华， 杨 欢*

(1.如皋市中医院药剂科，江苏 如皋 226500；2.江苏大学药学院，江苏 镇江 212013)

鳖甲为鳖科动物鳖TrionyxsinensisWiegmann的背甲，性微寒，味咸，归肝、肾经，有滋阴潜阳、退热除蒸、软坚散结[1]。鳖甲应用广泛，需求量大，市面上出现一些伪品，其中最为常见的是佛罗里达鳖Apaloneferox[2]。通过传统的性状、显微及理化方法难以实现其中鳖甲的准确鉴定。DNA分子鉴定特异性高，近年来发展迅速[3]。Hou[4]、刘晓帆等[5]分别利用COI barcoding鉴别海马、水蛭，周辰杰等[6]通过PCR鉴别不同来源鹿血，黄巧丽等[7]采用ITS序列鉴定了四叶参内生真菌为绿僵菌。2020年版《中国药典》中乌梢蛇等采用DNA条形码分子鉴定法，该技术要求COI序列保持完整，扩增产物需要测序，操作步骤繁琐，不适用于混合物。小儿肺咳颗粒中含有鳖甲和鸡内金2味动物药成份，经过提取与纯化后的DNA供试品无法通过COI条形码鉴定其基原，而特异性引物扩增是根据基因序列存在的差异所设计引物进行PCR实验，在检验过程中无需测序，且抗干扰能力较强，适用于混合物，弥补了DNA条形码技术的不足[8-11]。

根据鳖及佛罗里达鳖的线粒体全基因mtDNA序列的差异设计引物，基于特异性引物扩增建立具有较强专属性且能够简便快速地检测小儿肺咳颗粒中鳖甲方法，为成方制剂的质量控制提供可靠的检测方法，亦可为成方制剂中动物药的专属性鉴定研究提供一条新的途径。

1 材料

1.1 仪器 T-MS型混匀仪(美国Topscience公司)；AL104型电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；5424型小型台式离心机(德国Eppendorf公司)；TGL-16M型高速台式离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；NanoDrop 2000型核酸蛋白分析仪(美国Thermo公司)；LDZF-30L-Ⅱ型立式高压蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)；T100型PCR仪、Universal型电泳电源、Mini-Sub Cell GT型水平电泳槽(美国Bio-Rad公司)；GenoSens 1860型凝胶成像系统(上海勤翔科学仪器有限公司)。

1.2 试剂与药品 基原动物鳖和佛罗里达鳖分别于2016年11月购自江苏省镇江市，并经COI条形码鉴定分别为鳖科动物鳖TrionyxsinensisWiegmann和佛罗里达鳖Apaloneferox，凭证标本号201611PS10和201611AF03；小儿肺咳颗粒处方中除鳖甲外其余21味中药饮片(鸡内金、麦冬、黄芪、枸杞、胆南星、桑白皮、紫菀、款冬花、瓜蒌、淡附片、干姜、桂枝、青蒿、炙甘草、北沙参、地骨皮、酒大黄、陈皮、白术、茯苓和人参)均购自镇江市中医院，由该院药剂科孙小祥主任中药师鉴定为正品；10批小儿肺咳颗粒购自各地药房(表1)。乙醇、氯仿等(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。DNA提取酚试剂、dNTP Mix、DNA聚合酶、低电渗琼脂糖、Tris-base、Proteinase K、Ethidium Bromide、Low DNA Ladder(北京索莱宝科技有限公司)；特异性引物由生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 市售小儿肺咳颗粒信息

2 方法与结果

2.1 颗粒制备 黄芪、地骨皮、北沙参、麦冬、炙甘草、青蒿、桂枝、瓜萎、紫菀、桑白皮加水煮2次，每次2 h，滤过，合并滤液，浓缩成相对密度为1.26～1.30(80 ℃)的清膏；其余粉碎细粉，与上述清膏及适量蔗糖混匀，制成颗粒，干燥后即得小儿肺咳颗粒(P1～P7)；此外，将鳖甲更换为佛罗里达鳖甲制成小儿肺咳颗粒伪品(F1～F7)；不加入鳖甲则制成阴性制剂(N1～N7)。

2.2 供试品溶液的制备 分别称取小儿肺咳颗粒、伪品及阴性制剂各50.0 mg，加入2×CTAB提取液995 μL和2% β-巯基乙醇5 μL，混匀后置于65 ℃金属浴，600 r/min下水平振荡2 h，12 000 r/min离心10 min，取上清液加入等体积预冷的70%甲醇，混匀后于-20 ℃下冷冻1 h，离心10 min，弃去上清液，沉淀中加入2×CTAB提取液495 μL和2% β-巯基乙醇5 μL，振荡30 min，离心后取上清液，加入等体积酚-氯仿(1∶1)混合液，混匀后离心，上清液加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1)混合液，混匀，再次离心，取上清液并加入等体积预冷异丙醇和3 moI/L KAc溶液100 μL，混匀后置于-20 ℃下冷冻1 h，离心后弃去上清液，沉淀中加入500 μL预冷的70%乙醇洗涤，常温下晾干，残留物以25 μL TE缓冲液溶解，制得DNA供试品溶液，260/280 nm波长处测定吸光度(A)值，于-20 ℃下保存备用。

2.3 特异性引物的设计 从GenBank数据库中搜索下载鳖及佛罗里达鳖的mtDNA序列，并采用DNAMAN软件比对两物种的基因差异，然后以Oligo 7软件设计特异性引物，并通过NCBI Primer-BLAST评估，引物序列信息见表2。

表2 特异性引物

注：A为引物PP2，B为引物PA3。P1为自制正品制剂，F1为自制伪品制剂，N1为自制阴性制剂，M为DNA Ladder，B为空白对照。

2.4 PCR扩增 PCR反应体系由10×扩增缓冲液2.5 μL、dNTPs 0.5 μL、正反向引物各0.5 μL、模板DNA(10 ng)1 μL、DNA聚合酶0.125 μL、MgCl22.5 μL，再加入无菌双蒸水至25 μL，以鳖甲或佛罗里达鳖甲为阳性对照。扩增后将产物载入2%TBE琼脂糖凝胶进行分离，观察目的片段条带。优化退火温度(图1)，在各温度条件下均未观察到自制阴性制剂的扩增条带，表明除鳖甲外的其余饮片不影响特异性PCR扩增。当退火温度由56 ℃升高至60 ℃后，自制正品制剂的DNA经引物PP2扩增后产生较亮的条带，但是自制伪品制剂DNA亦产生扩增条带，而随着温度进一步升高到62 ℃，则未观察到非特异性扩增条带，因此选择62 ℃为引物PP2扩增时的最优退火温度。另一方面，当退火温度由56 ℃升高至60 ℃后，经引物PA3扩增后只观察到特异性扩增条带；当温度进一步升高，条带亮度减弱直至无任何条带，因此56 ℃被选择为PA3扩增时的最优退火温度。此外，优化循环数，当循环数为35次时(图2)，市售小儿肺咳颗粒总DNA经引物PP2或PA3扩增后，电泳中有条带出现，但是亮度较弱，为减少假阴性结果，选择更高循环数40次。在此基础上建立PCR扩增条件(表3)。

注：P1～P3为自制正品制剂，F1～F3为自制伪品制剂，N1～N3为自制阴性制剂，XR1～XR3为市售小儿肺咳颗粒，M为DNA Ladder，B为空白对照。

表3 PCR扩增条件

2.5 特异性及灵敏度考察 将不同批次的自制正品、伪品及阴性制剂按“2.2”项下方法制备DNA供试品溶液，并以其为模板进行PCR扩增及电泳分析，见图3。自制正品制剂DNA经引物PP2扩增后仅在183 bp处观察到扩增条带；自制伪品制剂DNA经引物PA3扩增后则仅在95 bp处产生条带，表明本方法具有良好的特异性。

注：T为阳性对照，P1～P7为自制正品制剂，F1～F7为自制伪品制剂，N1～N7为自制阴性制剂，M为DNA Ladder，B为空白对照。

将自制正品及伪品制剂的DNA供试品溶液以10倍比稀释，并以其为模板进行PCR扩增，见图4。当浓度稀释至10、1.0、0.10 ng/μL时，经引物PP2扩增后可检出鳖甲条带；随着浓度降低至0.010、0.001 0 ng/μL，未能检出条带。当浓度由10 ng/μL稀释至0.010 ng/μL时，经引物PA3扩增后可检出佛罗里达鳖甲条带；当浓度降低至0.001 0 ng/μL，则无法观察到条带，表明引物PP2及PA3的检测灵敏度分别为0.10、0.010 ng/μL。

注：A～E为10、1.0、0.10、0.010、0.001 0 ng/μL的模板DNA，M为DNA Ladder，B为空白对照。

2.6 市售小儿肺咳颗粒中鳖甲检测 对10批小儿肺咳颗粒中鳖甲进行检测。分别精密称取10批次的中成药样品粉末50.00 mg，按照“2.2”项下方法提取与纯化DNA，在“2.4”条件下扩增。由图5和表4可知，有4批检出鳖DNA，且未检出佛罗里达鳖DNA，表明其含有的鳖甲为正品；另外6批则两者DNA均未能检出。此外，可检出鳖DNA的4批小儿肺咳颗粒均来自于厂家B，而未检出的6批则均来自厂家A。

3 讨论

中成药成分复杂，所含动物药成分的显微特征通常较弱，鉴定难度较大。长期以来对动物药的指标性成分研究较少，常采用氨基酸测定、总蛋白质测定等方法，缺乏专属性鉴定手段。多拷贝mtDNA在加工产物中比单拷贝核DNA有更高的生存机会[12-13]，因而动物药饮片中留存的mtDNA较为丰富，可作为中成药中动物药成分的鉴定依据。本研究使用常规的DNA提取与纯化方法，并基于mtDNA种间差异设计的特异性引物能检出小儿肺咳颗粒中鳖甲及其常见伪品的动物基原。

注：T为阳性对照，XR1～XR10为市售小儿肺咳颗粒，M为DNA Ladder，B为空白对照。

表4 小儿肺咳颗粒的鉴定结果

据报道，除了佛罗里达鳖之外，鳖甲的伪品还曾出现过马来鳖Doganiasubplana、斑鳖Rafetusswinhoei和缘板鳖Lissemysscutata等；其中以佛罗里达鳖在国内养殖较多，是一种常见食用资源，易于获得，因而在研究过程中选择该伪品基原开展研究。