基因编辑猪的研究现状

翟利敏, 李文通, 冯政, 李华, 裴杨莉*

（1.佛山科学技术学院生命科学与工程学院, 广东省动物分子设计与精准育种重点实验室, 广东普通高校动物分子设计与精准育种重点实验室, 广东佛山 528225；2.中国农业科学院深圳农业基因组研究所, 广东深圳 518120）

猪是重要的农业经济动物, 猪肉是人类获得蛋白质营养的主要途径之一。优良的生产性状可为养猪业带来巨大的经济效益。猪与人的氨基酸同源性高达84.1%, 同时, 猪的解剖学、生理学及遗传背景、疾病特征、营养代谢等方面与人类极为相似[1], 且成本低、扩繁快、不涉及伦理学问题。因此, 猪在人类疾病模型、异种器官移植等医学领域也具有广阔的应用前景。随着基因编辑(gene editing)技术的快速发展, 出现了越来越多易操作、运用广泛且安全的新型编辑技术, 特别是规律性重复短回文序列簇(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/cas endonucleases 9,CRISPR/Cas9)技术, 可以快速完成单碱基编辑、基因敲除或敲入编辑, 得到编辑细胞后再借助体细胞克隆等技术制备基因编辑猪, 其在猪的生产性状改良及人类疾病模型、药用人源蛋白生产、器官移植供体等领域发挥重大作用。本文综述了基因编辑猪的制备及在农业领域、医学领域中的研究进展, 以期为猪的农业生产性状改良和医学研究提供参考。

1 基因编辑猪的制备方法

基因编辑技术能精确地对生物体基因组特定目标基因进行修饰。通过基因编辑技术可以删除和替换内源基因、插入外源基因等[2]。依据所用可编辑核酸酶的不同, 目前主流的基因编辑技术主要有3种：锌指核酸酶(zinc finger nucleases,ZFN)、类转录启动因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALEN)和规律性重复短回文序列簇(CRISPR/Cas9), 这3种技术均能高效地靶向基因并将多等位基因修饰引入体细胞。构建基因修饰猪常用的方法有体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)、原 核 注 射(pronuclear injection)、慢 病 毒 转 染(lentivirus transfection)和精子介导(sperm-mediated gene transfer)等。

1.1 SCNT法

SCNT法介导的基因编辑动物制备技术是将经基因编辑后的体细胞注入已去核的卵母细胞中形成重构胚, 再将重构胚移植到代孕母畜子宫内生产基因编辑后代。SCNT法是构建基因编辑猪最常用的方法, 主要步骤如下：①基因编辑的供体细胞制备与筛选；②体外成熟卵细胞的去核；③将供体细胞注入卵母细胞核；④重构胚的融合与激活；⑤重构胚的体外培养；⑥重构胚移植入代孕母猪子宫内获得基因编辑后代[3]。该方法的基因修饰在核移植供体细胞制备阶段, 得到阳性细胞便可用于核移植制备基因编辑猪, 无需漫长的繁殖试验便可获得多基因编辑猪[4-7]。

1.2 原核注射法

原核注射法是借助光学显微镜和显微操作仪, 将线性化外源DNA直接注入动物原核期胚胎的1或2个原核(通常为雄原核)内来制作基因编辑动物。通过原核注射法制备基因编辑猪的主要步骤如下：①外源基因表达载体的构建和用于注射DNA溶液的准备；②注射用胚胎准备；③显微注射；④注射胚胎的体外培养；⑤移植到受体输卵管或子宫角处；⑥对出生的幼仔进行基因型检测。猪卵母细胞的胞质内富含脂质, 显微镜下卵母细胞呈黑色, 不利于原核注射, 通常需要将卵母细胞高速离心, 使脂质沉积到一侧以暴露原核, 但这一操作对胚胎有损伤, 降低了胚胎的发育能力[2]。

1.3 其他方法

除了SCNT及显微注射外, 慢病毒转染法、精子载体法也能用来制备基因编辑猪。但由于慢病毒载体具有毒性且对实验室条件要求较高, 而精子载体法的重复性低、技术不稳定, 同时该法受精子质量、孵育条件和授精操作影响较大, 因此应用不广泛。另外, CRISPR/Cas9系统在胚胎发生过程可通过电穿孔法传递大分子物质。电穿孔法被广泛应用于小鼠基因编辑[8], 也被用于猪的基因编辑。电穿孔介导的基因编辑不需要专门的设备, 而且操作简单, 且合子存活率高。一般来说, 电穿孔进入细胞的分子摄取与场强、脉冲长度和脉冲个数成正比。与小鼠不同, 猪的体外受精卵/胚胎对电压敏感, 高电压对受精卵/胚胎有害[9-10]。因此, 在猪受精卵/胚胎上单独通过电穿孔导入大分子物质有困难。

2 基因编辑用于猪生产性状改良

中国地方猪具有饲料报酬低、贮脂力强、瘦肉率低等特点, 采用传统育种手段培育具有理想经济性状特征的群体所需周期很长, 需要耗费大量的人力、物力、财力, 同时性状改良的程度还受猪的品种特性及基因型的影响, 限制了我国猪种的遗传改良。随着基因编辑技术的飞速发展, 这一高效便捷的分子育种方式为快速改良或提高猪的生长率、背膘厚、瘦肉率、肉品质、抗病能力等农业生产性状提供了有效的解决措施。

2.1 高生产性能猪制备

提高猪的产肉量及胴体瘦肉率仍是目前猪育种的重要目标之一, 而口感好、营养健康的猪肉也越来越受消费者的青睐。研究发现, 胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2,IGF2)和肌肉抑制素(myostatin,MSTN)均能参与调控骨骼肌发育与脂肪沉积[11-12]。2018年, 中国科学院周琪院士团队利用CRISPR/Cas9系统对IGF2基因的第3个内含子进行编辑, 获得了IGF2基因编辑巴马猪, 该猪的产肉量和瘦肉率均显著提高[13], 首次证实编辑基因的非编码区也可以改善猪的经济性状。2019年, 中山大学陈瑶生教授团队获得了IGF2双等位基因缺失的编辑猪, 该猪同样具有较高的瘦肉率[12]。针对MSTN基因编辑猪的研究较IGF2更多。2015年, 中国农业科学院Qian等[14]制备出MSTN编辑的梅山猪, 该猪瘦肉率显著提高。同年, 吉林大学Wang等[15]利用无选择标记的Cas9/gRNA编辑成纤维细胞上的MSTN, 再通过体细胞核移植获得了MSTN双等位基因突变的8头克隆小猪, 这些猪肌纤维数目显著增加, 并呈现“双肌臀”现象。2016年, 湖北农业科学院郑新民团队运用CRISPR/Cas9和Cre-LoxP重组酶技术制备了无选择标记的MSTN基因编辑猪[16]。利用CRISPR/Cas9介导的DNA双链断裂随机修复, 在猪MSTN基因编码区仅插入单个核苷酸, 引发移码突变并完全破坏MSTN功能, 成功获得MSTN功能缺失的巴马香猪, 6月龄时其生长速度提高9.6%, 肌纤维数量提高23.1%, 表现出“双肌性状”[17]。2020年, Ren等[18]制备了MSTN敲除的梅山猪, 而且还发现MSTN通过MEF2C/miR222/SCD5级联调控猪皮下脂肪脂肪酸去饱和脂肪沉积。2021年, 彭定威等[19]利用CRISRP/Cas9技术对MSTN的第3外显子进行编辑, 破坏半胱氨酸节基元, 编辑后的MSTN失去对靶基因的抑制作用；制备的MSTN基因编辑猪(两广小花猪)杂合子的肩部和臀部肌肉较发达, 肌纤维横截面积显著减少, 肌纤维数量显著增多。中国农业科学院李奎教授团队在对MSTN长达10余年的研究中, 采用现代基因编辑技术结合育种技术, 针对MSTN的不同位点和不同猪品种, 开展了编辑猪的制备和多层次全方位的性能评估：大群体、长期且全面的性能测定揭示了MSTN基因缺失不仅可以大幅度提高瘦肉产量, 同时提升了猪肉的嫩度；并且不同品种提高瘦肉产量的模式明显不同；为育种工作者引进商业品种和个性化遗传改良本土地方品种提供了新策略；在猪肉营养方面, MSTN基因缺失猪具有高蛋白、低脂肪的特性, 还提高了有益多不饱和脂肪酸的比例, 不仅可以满足心脑血管疾病易发人群的特殊饮食需要, 也为消费者提供了全新的选择[11]。

猪肉中含有大量的饱和脂肪酸, 过量食用易引发高血压、高血脂、高胆固醇、动脉粥样硬化等疾病, 为了吃得更健康, 科学家在改变猪肉成分上开展研究。秀丽线虫的Fat-1(fatty acid desaturases-1)基因可编码ω-3多聚不饱和脂肪酸脱氢酶, 该酶能将ω-6多聚不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)转化成为相应的ω-3 PUFAs, ω-3 PUFAs具有改善血管功能、抑制血小板凝集、抑制慢性炎症、降低血糖、促进脑细胞发育、提高记忆力等有益功能[20]。哺乳动物体内并无将ω-6 PUFAs转化成ω-3 PUFAs的酶, 因此, 多个研究团队将秀丽线虫的Fat-1基因整合至猪基因组中, 成功获得转ω-3脂肪酸去饱和酶基因的转基因猪, 猪肉中ω-3量大大提高, 进而提升了猪肉的营养价值[21-24]。2019年, 华南农业大学吴珍芳教授团队成果制备出同时表达Fat-1和Fat-2的转基因猪, 该猪肌肉、脂肪等组织中的ω-3和ω-6 PUFAs含量显著提高[25]。

2.2 猪抗病育种中的应用

猪的各种传染性疾病给生猪产业会造成巨大的经济损失。包括猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、非洲猪瘟病毒(african swine fever virus,ASFV)等, 严重影响了国民经济、人类健康及动物福利和生产力。

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由PRRSV引起的高致病性传染病, 严重危害养猪业, 对种猪危害较大, 该病以妊娠母猪出现流产、死胎、木乃伊胎等生殖功能衰竭以及仔猪呼吸困难、败血症、死亡率高等为主要特征[26]。猪肺泡巨噬细胞上的清道夫受体蛋白CD163是猪呼吸与繁殖综合征病毒的主要受体。2016年, 美国密苏里大学Randall S Prather团队制备了CD163第7外显子编辑猪, 该猪可以抵抗NVSL97-7895病毒株的攻击[27]。同年, 密苏里大学与堪萨斯州立大学合作将猪CD163基因的SRCR5结构域替换为人CD163基因的SRCR8结构域, 该编辑猪可抵抗PRRSVⅠ型毒株[28]。2018年, 吴珍芳教授团队成功制备出CD163敲除猪, 该猪能完全抵抗高致病型蓝耳病毒株(HP-PRRSV)[29]。2020年, 中国农业科学院李奎教授团队同时编辑了CD163基因第7外显子和猪氨基肽酶(porcine aminopeptidase,pAPN)基因的第2外显子, 成功制备了CD163和pAPN同时失活的双基因编辑大白猪[30]。该猪可同时抵抗PRRSV和传染性胃肠炎病毒感染, 并明显地抑制了猪德尔塔冠状病毒的感染, 这是全球首例抗3种重大疫病猪育种材料, 且该猪生长发育正常, 为开辟同时抗多种疾病猪的制备提供了参考。

非洲猪瘟(ASF)是由ASFV感染家猪和野猪而引起的一种急性、烈性、高度接触性的传染病, 对全球养猪业造成严重的经济损失。甚至导致部分地方猪种的灭绝。目前针对ASFV的各种疫苗仍不具良好的保护效率[31]。2016年, Lillico等[32]发现, 非洲疣猪携带ASFV但不发病, 而家猪感染ASFV后, 死亡率却高达100%；分析2品种猪的基因组测序结果发现, 家猪与非洲疣猪的RELA基因(NF-κB转录因子的1个亚基, 在调节对感染的免疫反应中起关键作用)上存在3个SNP位点的差异。他们利用基因编辑技术将家猪RELA的SNP位点精确替换为非洲疣猪的SNP, 成功获得基因编辑猪；后续攻毒实验显示, 改变2个位点的家猪临床、病毒学和病理参数与普通家猪无显著差异；而改变3个位点全编辑的家猪, 在部分编辑猪中观察到感染ASFV后临床症状出现延迟, 血液样本和鼻腔分泌物中病毒DNA较少[33], 这给抗非洲猪瘟猪的制备带来了希望, 不过后续还需找出更有效的编辑位点。

另外, 2020年, Xie等[34]利用CRISPR/Cas9技将猪RSAD2(pRSAD2)基因插入猪ROSA26位点, 并成功制备了组成性过表达pRSAD2的敲入猪(pRSAD2-KI), 病毒攻击实验表明, 从pRSAD2-KI猪分离的成纤维细胞减少了典型猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)感染。同年, Huang等[35]利用CRISPR/Cas9和Cre/loxP系统产生无标记猪β-防御素2(porcine beta-defensin 2,PBD-2)敲入猪, 提高了猪体内PBD-2蛋白的水平。而PBD-2是多功能阳离子肽, 在猪的不同组织中表达, 具有抗菌、免疫调节和促生长等作用, 高表达PBD-2的猪也许具有更强的抗病能力, 这一模型猪为抗病猪选育提供新材料。

若采用基因编辑技术获得同时抗PRRSV、ASF、流行性腹泻等一系列病, 且瘦肉率高、口感好、营养健康的猪育种新材料, 这将极大推动家畜抗病研究, 改善养殖过程中的动物福利。

3 基因编辑猪在医学研究的应用

猪的基因组、疾病特征、器官大小等方面与人类非常相似, 在医学方面是比较理想的大动物模型。随着基因编辑技术的飞速发展, 基因编辑猪在医学领域的应用也越来越广泛, 利用基因编辑技术对猪的基因进行改造, 基因编辑猪可以作为人类疾病模型、异种器官移植供体, 还可作为生物反应器生产药用蛋白, 基因编辑猪具有很好医学研究价值, 对人类的医学研究起到了很大的推动作用。

3.1 猪在医学研究中的优势

猪的大部分组织器官在结构和生理上与人类相似[36], 包括心脏和循环系统、肾脏、胰腺、肝脏、肺及皮肤, 其中皮肤与人类皮肤几乎无差别。很多能诱发人类疾病的基因和蛋白变异在猪上同样存在, 例如阿尔茨海默病、帕金森氏症以及肥胖症[37], 因此, 猪可作为人类疾病研究模型。

猪也是人类器官移植的合适供体之一, 但最适于医学研究的猪品种仍无定论, 其中能否做供体的标准是器官达到特定大小时的猪龄。很多实验室用家猪来改造成潜在异种移植供体, 但家猪成年时体重与人类正常体重相差甚远, 大约1岁后家猪的器官体积便过大, 无法用于人类器官移植。相比之下, 小型猪的体重与人类体重相似, 因此它们的器官在任何年龄都有潜在的应用前景。尽管目前尚不清楚移植后器官的生长潜能与供体和受受体器官大小的控制程度, 但将普通家猪的肾脏移植到小型猪体内, 3个月后移植的肾脏体积为初始体积的3.7倍, 而相同时间内正常的小型猪肾脏的体积为初始体积的1.2倍[38]。同样的情况也发生在肺移植猪上, 肺的生长比率增加, 导致器官功能受损。将家猪的器官异种移植到狒狒体内后, 器官快速生长, 最终导致皮质坏死[39]。因此, 小型猪更适合作为器官供体。

猪的繁殖特性也使猪有利于基因编辑动物的获得。它们产仔量大、性成熟早(5个月)、孕周短(114 d)、发情周期频繁(每3周1次)[40]。因此, 可以在较短的时间内生产出基因编辑纯合子猪。

动物界中非人灵长类动物与人类的亲缘关系最近, 其解剖学、生理学、营养代谢、疾病特征等与人类相似度最高, 但是非人灵长类动物资源匮乏、成本高, 对其进行基因修饰及胚胎操作难度较大, 而且相关试验会受伦理限制。而猪群体大、饲养成本低、基因编辑及胚胎操作技术成熟, 作为医学动物模型受到的伦理争议较非人灵长类动物少。

鉴于猪的器官大小、繁殖性能、生理特性、成本低、伦理争议少等特点, 猪在人类疾病模型、药物开发、生产人源蛋白、器官移植供体等方面很具有应用前景。

3.2 疾病模型猪

猪是目前生物医学研究中重要的大型模式动物之一。猪有许多人类疾病, 如心血管疾病、肥胖症和糖尿病等。通过模式动物可以研究那些自然发生或者由于基因突变引起的疾病的发病机制。基于基因操作手段获得的人类疾病模型猪对研究人类疾病的发病机理、开发医疗诊断新技术等具有重要意义。猪作为人类疾病研究的模型动物可追溯到1998年[41]。目前, 研究人员已经成功建立了大量的人类疾病模型猪, 包括心血管疾病[42]、免疫疾病[43-44]、神经退行性疾病[45-46]、遗传性疾病[47]、癌症[48]、代谢病[49]、肾病[50]等, 这些模型对于揭示疾病发生的机制、寻找药物靶点、开展药物筛查和药效评价、探索治疗及诊断疾病的方法等均具有重要意义[51]。

由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)感染引起的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)席卷全球。当前新冠病毒变种在全球流行的范围更广, 针对COVID-19的动物模型会显著加快SARS-CoV-2/COVID-19的临床救治和药物、疫苗研发等相关研究进展。目前已有多团队已经制备了人血管紧张素转换酶2(human angiotensin converting enzyme 2,hACE2)转基因小鼠及恒河猴动物模型, 但它们感染SARS-CoV-2后, 只是体重减轻, 出现肺炎的迹象, 但症状并不严重[52-54], 与人类的病理过程相差甚远。2021年, 中国农业大学吴森教授领衔多团队制备了新冠肺炎猪模型, 该猪的ACE2被hACE2取代, 从hACE2人源化猪模型的肺和肾中分离出来的原代上皮细胞对SARS-CoV-2的感染高度敏感, 并表现出明显的细胞病变效应和对病毒N蛋白的高免疫荧光信号[55]。但该模型并未开展活体攻毒实验, 是否更适合用于COVID-19相关研究有待更多实验的验证。

营养和能量过剩会导致身体处于慢性低度炎症状态, 引发代谢性炎症性疾病,含肥胖、2型糖尿病、脂肪肝、动脉粥样硬化[56]。2021年, 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所杨述林研究员带领团队成功构建了人类代谢性炎症模型猪, 他们利用多基因定点整合技术, 将人类3种代谢性疾病易感基因(GIPRdn、hIAPP和PNPLA3I148M)转入猪基因组, 并由组织特异性启动子调控GIPRdn和hIAPP在胰岛β细胞表达, 调控人PNPLA3I148M在肝脏中表达, 该猪模型表现出葡萄糖耐量受损、脂肪性胰腺、脂肪和肝脏慢性炎症等病理特征。该猪模型脂肪和肝脏代谢炎症触发及级联分子特征与人类高度相似, 适宜作为临床转化医学研究的实验材料[57]。

猪在研究心血管疾病、免疫缺陷模型、脂代谢异常疾病模型、癌症模型、神经退行性疾病、遗传疾病等方面都作出卓越贡献[58]。随着研究的不断深入, 发现很多疾病并不是由单一基因控制, 猪与人虽然相识度很高, 但还是存在一定的差异, 即使编辑了人类的某些关键基因, 但模型猪有可能体现不出人类的疾病特征[59]。因此, 要得到更完美的疾病模型猪, 一方面需要寻找更关键的致病基因, 另一方面要制备多基因编辑猪。

3.3 器官移植供体猪应用难关

器官移植是终末期器官衰竭患者的最佳治疗手段, 目前慢性疾病的患病率仍在缓慢提高, 但器官捐献数量有限, 器官供体存在很大的缺口。异种器官移植被认为是缓解人类供体器官短缺的重要途径[60]。猪的解剖特征、生理指标、血型抗原等都与人的极其相似[61],是很好的异种器官移植供体。然而, 安全有效地开展猪器官异种移植还存在两大障碍：①免疫排斥；②猪携带的内源性逆转录病毒(porcine endogenous retroviruses,PERVs)具跨物种传播风险[62]。而针对特定基因进行修饰的基因编辑猪, 能成功翻越这些障碍。

3.3.1 降低移植后宿主免疫排除反应 移植免疫排斥反应是器官移植后宿主机体对移植物通过特异性免疫应答使其破坏的过程[61]。器官移植异种排斥包括先天性免疫(innate immunity)与适应性免疫(adaptive immunity)应答。参与先天性免疫的有单核细胞(monocytes)、巨噬细胞(macrophages)[63]、自然杀伤(natural killer, NK)细胞[64], 补体及凝血级联途径[64]。另外, 天然抗体(natural antibodies,NAbs)通常也被定义为先天免疫的成分之一。天然抗体最重要的作用是识别α-1,3-galactose(Gal)。Gal是一种碳水化合物, 存在猪和大多数哺乳动物(人类和东半球猴子除外)细胞表面的糖蛋白和糖脂上, 而人类祖先在进化过程中1,3-半乳糖基转移酶(α-1,3-galactosyltransferase,Gal T)发生了移位突变, 使得细胞表面不再存在Gal。因此, 引起免疫排斥的主要因素是人的天然异种抗体识别猪细胞表面的异种抗原Gal表位。2002年, Lai等[65]成功获得了α-1,3-半乳糖基转移酶(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)基因敲除猪, 能阻断Gal表位生成, 克服了异种器官免疫排斥问题。2011年, Hauschild等[66]通过ZFN编辑技术敲除GGTA1双等位基因, 并成功制备了α-1,3-半乳糖基因敲除猪。后续研究显示, 敲除GGTA1能成功避开发生在移植后几小时内发生的超急性排斥反应(hyperacute rejection,HAR), 但在术后几天至几周会发生延迟性异种移植排斥反应(delayed xenograft rejection,DXR)；而这主要是由另外2种免疫抗原-单磷酸胞嘧啶-N-乙酰神经氨酸羟化酶(cytidine monophosphate-nacetylneuraminic acid hydroxylase, CMAH)基因编码的β-1,4-N乙酰半乳糖氨基转移酶2(β-1,4-Nacetylgalactosaminyl transferase 2,b4GALNT2)和N-羟乙酰神经氨酸(N-g1yco1-ylneuraminicacid,Neu5Gc)引起的[67-69]。2017年, Gao等[70]利用CRISPR/Cas9系统在猪胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblasts,PFFs)中同时敲除GGTA1和CMAH基因, 并成功获得了11头具有相同表型的双等位基因GGTA1/CMAH DKO仔猪；与来自GGTA1基因敲除猪的细胞相比, 来自GGTA1/CMAH DKO猪的细胞中人抗体结合和抗体介导的补体依赖性细胞毒性显着降低, 这说明编辑猪在异种移植后体液排斥反应减轻。

针对早期抗体介导的异种移植排斥反应, 科学家也对其他基因进行了编辑。①人血红素氧化酶-1(human heme oxygenase-1,hHO-1)基因。HO-1通过抗炎、抗凋亡、抗增殖等作用, 帮助细胞免受氧化损伤[71]。②人肿瘤坏死因子(human tumor necrosis factor,TNF)基因hA20。其编码锌指蛋白酶, 可以抑制核因子κB(nuclear factorκB)的活化和TNF介导的细胞凋亡。该基因仅在猪的心脏表达, 能部分抑制缺血-灌注损伤, 但不能增加器官存活率。③在内皮细胞(endothelial cells,ECs)表面表达的抗凝血蛋白人血栓调节蛋白(human thrombomodulin)基因CD141。对猪心脏进行该基因修饰后有助于受体狒狒的长期存活[72-73]。④猪血管性血友病因子(von willebrand factor,vWF)基因的修饰。vWF是一种糖蛋白, 通过与稳定因子Ⅷ结合, 诱导血小板在血管损伤部位黏附。希望改良猪能减轻灵长类动物血液与猪ECs的凝血诱导。这种保护作用已在体外得到证实, 但其对异种移植物存活的影响尚未确定。⑤外核苷三磷酸二磷酸水解酶-1（ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1, entpd1或hCD39)基因。其编码的酶将三磷酸腺苷和二磷酸腺苷水解为一磷酸腺苷, 随后水解为腺苷, 具有抗血栓和心血管保护作用, hCD39转基因已应用至多种猪移植模型中[74]。

在移植后, T细胞可直接攻击移植物, 还可促进B和NK细胞反应[75-76]。在猪-猴异种移植中, 免疫抑制治疗并不能完全控制T细胞反应, 包括细胞毒性、细胞因子产生以及固有细胞毒性细胞的募集和活化[77-78]。利用基因编辑技术来消除T细胞的免疫应答, 使异种器官不受免疫攻击也备受关注。科学家已试着将Fas配体[79]、CTLA4Ig[80]和抗CD2单克隆抗体[81]引入源猪体内, 旨在实现移植后的抑制局部免疫反应。转CTLA4Ig基因的猪会出现全身免疫抑制, 这些猪已被证明具有繁殖能力[80], 从它们身上移植的角膜在非人灵长类动物中显示出更高的存活率[82]。然而, 异种移植免疫逃避会破坏移植后个体的免疫保护能力, 还需要通过深入研究引入更好的方式。

3.2.2 清除猪内源性逆转录病毒 除了猪与人的免疫相容性问题外, 猪携带的内源性逆转录病毒(porcine endogenous retroviruses, PERVs)也阻碍了异种器官移植的临床应用。PERVs是嵌在猪基因组的病毒, 在猪体内不具毒性, 但当猪细胞和人细胞接触时, 这种病毒会从猪基因组“跳”至人基因组中, 对人形成毒性。Yang等[29]证明了在永生化猪细胞系中灭活PERVs活性的可行性, 2017年, 哈佛大学医学院遗传学教授Boeke等[83]在Science杂志上宣布培育出世界首批不携带内源性逆转录病毒的“猪1.0”, 从根本上解决PERVs可能导致病毒跨物种传播的风险。2018年, 该团队的“猪2.0”诞生, 又进一步解决了异种器官移植免疫排斥问题[84]。小猪3.0在PERVs敲除的小猪体内进一步移除了3个激活免疫反应的基因, 插入了6个移植人体免疫反应的基因和3个调节免疫反应的基因。这些小猪细胞与人类抗体结合率降低了90%, 人体免疫排斥反应将大大减轻, 而且这些小猪都很健康, 生育能力强劲, 器官功能正常。这些基因编辑猪, 为实现异种器官移植提供了关键的材料, 也是后续开展移植实验的基础。

4 基因编辑猪存在的问题及发展趋势

结合基因编辑及体细胞克隆技术制备的基因编辑猪, 在猪的经济性状改良、抗病性能提高及人类疾病病理和异种器官移植研究等方面应用前景巨大。但是基因编辑猪的产业化应用仍存在很多问题：首先, 基因编辑过程中借助同源定向修复的精确敲入(knock in,KI)及定点突变效率较低；其次, 基因编辑技术仍有明显的脱靶效应, 给基因编辑猪的制备带来了不确定性, 在很大程度上限制了基因编辑猪的产业化；第三, 通过体细胞克隆技术制备基因编辑猪的效率低；另外, 优良的性状或人类疾病的精确模拟大多数受多基因的控制, 因此是需要针对多基因进行编辑的。

针对存在的问题, 可以从以下几个方面改进：①改良基因编辑技术, 提高基因组定点修饰效率, 降低其脱靶效应；②寻找提高克隆猪生产效率的更佳方法；③优化多基因编辑猪制备流程, 实现猪的多性能改良, 最大程度地降低免疫排斥及彻底清除PERVs, 更准确地模拟人类疾病；④优化基因编辑猪的每个环节, 降低制备成本；⑤基因编辑猪市场化相关法律条例的颁布也迫在眉睫。基因编辑猪的相关研究无疑将为农业性状改良、生物医学的快速发展提供动力。

5 结语

目前, 已有一系列编辑猪模型问世, 但基因编辑猪的产业化应用仍有诸多困难。如基因编辑技术目前仍存在体内导入效率低、基因编辑效率低、潜在脱靶效应等缺点；目前建立的疾病模型还不能精确地模拟人类疾病特征；进一步降低异种器官移植后宿主对外源器官的免疫排斥；彻底清除猪体内携带的内源性病毒；在改良生长性状时, 最好是基因结构改变小、不影响基因其他功能的编辑方法。尽管如此, 基因编辑猪的研究无疑能在生物医学及农业领域发挥巨大作用。因此, 未来的发展要加大原创性的研发力度, 规模化技术体系, 实现更高效、更精细、更便捷、多层次、多基因编辑, 推进相关法律标准的制定, 使基因编辑猪能尽快的进入市场。