中国汉族人群NR3C1 MTHFR和IGFBP3基因多态性及DNA甲基化与激素性股骨头坏死风险的相关分析

倪 琼 詹庆昊 黄荣兰 胡文彬 杨任民 程 楠 韩永升

股骨头坏死是由于股骨头血供中断引起骨细胞的凋亡和股骨头内微结构的改变，出现股骨头区域疼痛并进行性加重的一种疾病。大多数患者最终需要进行人工关节置换，长期效果难以预测[1]。研究[2]已确定过度饮酒和服用大剂量糖皮质激素药物是发生非创伤性股骨头坏死的2个最重要的诱因。因此，激素性股骨头坏死(steroid-induced osteonecrosis of the femoral head，SONFH)的早期检测、有效治疗尤为重要。近年来，基于候选基因的关联研究成功地定位了许多复杂疾病的易感性[3-4]，也有研究[5]将特定基因与股骨头坏死联系起来，表明遗传因素可能与股骨头坏死的发生有关。

糖皮质激素受体基因NR3C1是介导糖皮质激素发挥作用的重要转录调控因子，存在较多的突变及多态性，影响个体对外源性糖皮质激素的敏感性[6]。NR3C1 BclI (rs41423247)基因多态性是一种比较常见的多态性变异，并已报告与高血压和糖皮质激素敏感性增加有关[7-8]。NR3C1rs6196 A等位基因携带者与G等位基因携带者相比，有更高的糖皮质激素耐药风险。与G等位基因相比，rs10052957和rs258751 A等位基因的存在可以降低糖皮质激素耐药的发生率[9]。NR3C1 DNA甲基化与抑郁、焦虑、创伤后心理压力紧张综合征、神经性贪食症和边缘性人格障碍有关[10-13]。亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)基因可编码5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶，MTHFR的基因突变会显著降低酶的活性，导致血浆同型半胱氨酸水平升高，从而增强了破骨细胞活力对骨组织产生直接的损害作用[14]。MTHFR基因的677C>T(rs1801133)变体与血浆同型半胱氨酸水平升高有密切的联系[15]。较高的同型半胱氨酸浓度可能会阻碍胶原的合成，进而导致骨质量的下降和股骨头坏死风险的增加[16]。同型半胱氨酸升高与rs1801133多态性和低甲基化之间有相关联系[17]。胰岛素样生长因子结合蛋白-3(insulin like growth factor bind protein 3,IGFBP3)是血清IGF1的主要载体，通过与配体竞争性结合抑制IGF1。IGF1通过自分泌和旁分泌调节成骨细胞的增殖和分化[18]。IGFBP3基因的DNA甲基化能通过神经体液、炎症、氧化应激等机制来调控基因表达和影响疾病发生发展。有研究[19-20]证明影响血管的IGFBP3基因的SNPs与多个CpG位点的甲基化有关。

DNA甲基化是目前研究最为深入的一种表观遗传修饰，可对转座子和基因表达产生抑制，也可激活一些基因的转录。笔者先前已证实基因CYP450的rs2242480 T等位基因与SONFH发生风险降低相关[21]。目前，只有少数研究探讨NR3C1, MTHFR和IGFBP3基因多态性和甲基化与 SONFH的关系。本研究对上述3个基因的SNP位点及阳性位点的DNA甲基化水平进行测定，以期进一步了解SONFH的生物学和生理学机制，为该病的个体化治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2018-2021年共招募了来自安徽中医药大学神经病学研究所附属医院、安徽中医药大学第一附属医院、安徽医科大学第一附属医院和宿州医院、合肥市第八人民医院、中山大学第三附属医院和南昌大学医学院第二附属医院等共82例股骨头坏死患者。其中79例患者有在患视神经脊髓炎病、多发性硬化、重症肌无力、急性淋巴细胞白血病或系统性红斑狼疮等疾病接受短期冲击或长期口服糖皮质激素治疗史，为本研究的病例组，均符合SONFH的诊断标准[22]。3例患者因其他非糖皮质激素原因造成的股骨头坏死被排除在外。根据安徽中医药大学神经病学研究所附属医院的医学检查，招募了口服糖皮质激素(强的松>30 mg/d)治疗3个月后,临床观察3年以上未发生股骨头坏死的114例患者作为对照组，所有参与者为在合肥及周边地区居住或住院就诊的中国汉族人口。每位参与者均签署一份知情同意书。安徽中医药大学神经病学研究所附属医院伦理委员会批准了该研究[伦理批号：2018伦字(07)号]。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：①长期口服或短期冲击使用糖皮质激素，累计相当于强的松>30 mg/d超过3个月；②采用《中国成人股骨头坏死临床诊疗指南(2020)》[23]确诊为SONFH的患者；③均摄双侧髋关节正、蛙位片和双髋磁共振检查；④签署知情同意书。排除标准：①未获得知情同意者;②创伤性股骨头坏死及其他非糖皮质激素原因造成股骨头坏死者;③病史不全或严重缺陷影响观察者。

1.3 提取基因及基因分型 基因组DNA提取使用DNA纯化试剂盒(Promega, Madison, Wisconsin, USA)，按照产品说明书进行。目标基因SNP位点采用Genesky生物技术公司(上海，中国)开发改良的iMLDR技术进行分型。采用多重聚合酶链式反应(PCR)检测进行iMLDR的研究。对每个单核苷酸多态性，用不同的荧光标记来区分等位基因特异性寡核苷酸探针对。不同的SNP在3'端被进一步区分为不同的延长长度。设置两组阴性对照:一组以双蒸馏水为模板，另一组为不加引物的DNA样品，其他条件保持不变。采用ABI3730XL自动测序仪(Applied Biosystems)对占总DNA样品约5%(n=20)的随机样本进行直接测序，以确认iMLDR的结果。

1.4 CpG岛选择 选取位于NR3C1、MTHFR和IGFBP3基因近端启动子的CpG岛，按照以下标准进行测量:①最小长度为200 bp;②GC含量在50%以上;③0.60或更高的观察/预期二核苷酸CpG比值。

1.5 亚硫酸氢盐转换和多重放大 DNA甲基化水平采用甲基化靶(MethylTargetTM, Genesky Biotechnologies Inc， Shanghai, China)分析，这是一种基于NGS的多靶点CpG甲基化分析方法。利用基因CpG软件对感兴趣的基因组区域进行分析，并将其转化为bisulfit-convert序列。利用硫酸氢盐转化DNA的甲基化引物软件设计PCR引物。使用EZ DNA甲基化TM-GOLD试剂盒(Zymo Research)按照制造商协议对基因组DNA(400 ng)进行亚硫酸钠处理。用优化的引物组合进行多重PCR。

1.6 测序 将来自不同样本的库进行量化并汇集在一起，在Illumina NextSeq平台上进行排序。测序采用2×150 bp双端模式。

2 结果

2.1 一般资料比较 病例组79例，其中女性45例，男性34例，平均年龄(50.65±13.95)岁；对照组114例，其中女性65，男性49例，平均年龄(42.63±19.27)岁。病例组与对照组相比，年龄差异有统计学意义(t=3.331，P=0.001)，性别差异无统计学意义(t=0.127，P=0.899)。

2.2 SNP位点信息及Hardy-Weinberg平衡检验 选择了5个SNP位点(NR3C1基因的rs10052957、rs41423247位点；MTHFR基因的rs1801133位点；IGFBP3基因的rs2453839、rs3110697位点)，对所有样本采用iMLDR技术进行基因分型并做HWE检验质控，所有位点的P值均>0.05，符合平衡，数据可用。见表1。

表1 SNP位点信息与Hardy-Weinberg平衡检验

2.3 SNP位点等位基因及基因型频率与SONFH的关联分析 病例组与对照组中的5个SNP位点的2个等位基因频率在logistic回归分析中发现，rs3110697位点与SONFH有关联，差异有统计学意义(P<0.05)。rs3110697位点的基因型频率分布差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 对照组和病例组等位基因和基因型频率与SONFH风险的相关性分析

2.4 SNP位点与SONFH的遗传模型关联分析 遗传模型分析发现，IGFBP3基因的rs3110697位点，在隐性遗传模型下，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 病例组与对照组遗传模型分析

2.5 连锁不平衡分析 对NR3C1及IGFBP3的SNP位点使用haploview软件进行连锁不平衡分析存在关联的单倍型，发现SNP位点间均不具有较强的连锁关系。见图1。

注：方框中的颜色与数字均表示SNP之间的连锁程度强弱，数字越大，表示SNP之间关联性越强。

2.6 甲基化数据分析

2.6.1 甲基化检测片段信息 采用Primer3(http://primer3.ut.ee/)软件对亚硫酸氢盐处理之后的序列进行引物设计。见表4。

表4 甲基化检测片段引物序列信息

2.6.2 CpG位点甲基化水平差异 本研究共检测CpG位点164个，对每个CpG位点甲基化水平进行差异显著性检验，筛选具有显著甲基化水平差异的CpG位点。病例组与对照组相比，CpG位点IGFBP3_2-143，MTHFR_1-36、-77、-139，MTHFR_2-42，NR3C1_2-163，NR3C1_4-47逻辑回归检验P<0.05，差异有统计学意义。见表5。

表5 CpG位点甲基化水平显著差异信息

2.6.3 SNP位点与甲基化交互作用分析 通过基因表达数量性状定位(expression quantitative trait loci,e QTL)作图方法将所有SNP分型结果与对应位点基因甲基化水平交互作用进行线性回归分析。共10对SNP与甲基化位点之间的线性回归检验P<0.05，差异有统计学意义。见表6。

表6 SNP和CpG位点间交互作用的meQTL分析

3 讨论

近年来，糖皮质激素已被认为是引起非创伤性股骨头坏死的首要致病因素[24]。既往研究[25]证实，大多数糖皮质激素的作用是由糖皮质激素受体介导的。糖皮质激素受体由激素结合域、DNA结合结构域和氨基末端区域组成，在糖皮质激素敏感性中起决定作用[26]，其作用的分子机制的改变能改变组织对糖皮质激素的敏感性从而导致耐药或过敏，并引起严重的并发症。股骨头坏死(osteno narosis of the femoral head,ONFH)和低纤维蛋白溶解或血栓形成倾向之间的遗传联系已经被报道过[27]，MTHFR和血浆纤溶酶原激活抑制剂-1(PAI-1)等凝血相关因子与ONFH的发生有关。因此，凝血和血管生成机制也被认为是影响ONFH的主要因素。本研究希望通过对SONFH相关基因NR3C1、MTHFR和IGFBP3多态性及DNA甲基化水平交互作用的遗传结构研究，探讨该病的发病机理，以期为疾病的诊疗提供依据。

NR3C1的rs41423247多态性是糖皮质激素受体基因外显子2内含子2连接区下游的C→G核苷酸发生变化[28]，与类风湿性关节炎和健康人对外源性糖皮质激素敏感性的变化有关[29-30]。本研究中，首次筛选出了NR3C1_2-163和NR3C1_4-47 2个显著甲基化水平差异的CpG位点，发现NR3C1基因SNPs与DNA甲基化之间具有相关性，表明NR3C1基因的表观遗传修饰可与基因多态性产生交互作用，为SONFH的发病机制研究提供了新的视角。但没有发现NR3C1基因型频率与SONFH的易感性关系，这可能与本研究选择的研究对象有关，本研究招募的对照组人员来自同一所医院，但是SONFH患者血液标本却是从不同医院获取，在关联分析中受人口混杂因素影响。进一步研究，需要控制地区差异对研究结果的干扰。

MTHFR的rs1801133多态性是由第677位点突变导致的，突变导致的酶活性下降可引起同型半胱氨酸水平增高[31]。同型半胱氨酸会影响创伤愈合、骨骼重塑。Zalavras等[32]在66例患者的对照研究中报道了非创伤性股骨头坏死的发生率与rs1801133基因突变有显著的统计学差异。有研究不支持此结果，韩国的一项包含443例ONFH患者和273名健康受试者的病例对照研究对15个SNPs进行了基因分析，发现MTHFR基因的rs1801133多态性与非创伤性股骨头坏死基因易感性之间并没有明显的联系，但作者认为地区和种族的不同可能影响了个体间的MTHFR基因多态性[33]。Shang等[34]对MTHFR基因rs1801133多态性与ONFH的相关性研究进行了进一步的Meta分析，发现在亚洲人群中找不到rs1801133多态性与ONFH的相关性，但是在非洲人群中可以找到与ONFH的重要联系，认为MTHFR基因的rs1801133多态性是非洲人群ONFH的主要危险因素。Chai等[35]的Meta分析对种族进行分层，结果显示ONFH易感性和rs1801133多态性之间没有直接联系。基于以上研究结果，课题组把rs1801133纳入本研究中，单独分析了ONFH中的SONFH，希望可以解释文献报道的MTHFR基因与SONFH的各种关联。但是本研究结果也与多数研究结果一致，并没有发现rs1801133多态性与SONFH的显著相关性。需注意，本研究不包括对止血机制的评估，此外，本研究也没有测量同型半胱氨酸水平，rs1801133多态性可能通过促进血管内凝血导致SONFH的假设仍有待证实。但本研究在分析SNPs与甲基化水平交互作用时，得出MTHFR1-36、MTHFR_1-77、MTHFR_1-139、MTHFR_2-42等位点的甲基化水平差异存在统计学意义。说明在SONFH的发生发展中，MTHFR的表观遗传学可能是连接环境因素和SONFH基因相互作用的重要桥梁。

IGFBP3是IGF1在血循环中的主要载体，能够延长IGF1在血液循环中的半衰期。IGF1能够促进骨骼细胞增殖，增加骨骼长度，参与了蛋白质代谢调节，诱导维生素D活化[36]。IGFBP3在缺氧诱导的血管生成中发挥作用[37]，并且与动脉粥样硬化有关[38]。有研究观察IGFBP3rs2453839与子宫内膜癌风险关系时，证实IGFBP3的遗传变异可能影响白种人的子宫内膜癌风险[39]，涉及到了种族因素。Hong等[40]采用Affymetrix靶向基因分型3K芯片阵列对460例ONFH患者和300例对照者进行了相关研究，发现韩国人群中IGFBP3基因的SNPs与ONFH风险增加有关；rs2453839在隐性模型中与酒精诱发的ONFH和特发性ONFH有显著相关性；携带rs2453839的小纯合子等位基因(CC)的受试者有较高的ONFH发病风险。Song等[41]纳入ONFH临床分期，得出与正常对照组相比，SONFH组IGFBP3rs2453839 TT和CT频率分别呈上升和下降趋势；多态性与临床表型的关联分析表明IGFBP3基因rs2453839 TT型SONFH患者的病程明显短于CT+CC携带者。Ⅲ/Ⅳ期双侧髋部病变组CT+CC基因型频率显著高于Ⅲ/Ⅳ期单侧病变组和Ⅱ/Ⅲ期双侧病变组。另一项对照研究中，IGFBP3基因rs3110697和rs2453839的主要模型与ONFH的风险增加显著相关，rs2453839的基因型也与临床分期密切相关；与对照组相比，ONFH组中IGF1的统计量增加了，血清三酰甘油和低密度脂蛋白胆固醇水平相较于对照组明显升高，但血清高密度脂蛋白胆固醇水平相较对照组则明显降低[42]。因此，本研究认为IGFBP3基因多态性可能影响血液循环，损害股骨头，进一步导致SONFH。在本研究中，证实了IGFBP3基因的rs3110697多态性与中国汉族人群SONFH的发生有关。与对照组相比，rs3110697的A/G基因型携带者患病风险较低；在隐性遗传模型中，rs3110697的A等位基因携带者的患病风险也较低。本研究发现CpG位点IGFBP3_2-143可能与IGFBP3基因多态性有相互作用，从而影响SONFH的发生；但没有发现rs2453839多态性与SONFH的相关性。

综上所述，SONFH是一个多基因遗传病，涉及激素受体、代谢转运、氧化应激、遗传、神经突触、脂质及骨代谢等多种机制，本研究首次证实了在中国汉族人群中NR3C1、MTHFR和IGFBP3基因的表观遗传修饰可与遗传基因多态性产生交互作用影响SONFH，基于对该病的遗传结构特征的研究可以准确把握该疾病的发展规律。

本研究也存在一些局限性。首先，本研究不包括生物学功能的分析，这对阐明NR3C1、MTHFR和IGFBP3基因在SONFH的作用至关重要。另外，糖皮质激素治疗病例中的骨坏死并不意味着单纯的糖皮质激素可能导致它。应考虑所有可能的风险因素，如基础疾病，因为在大多数情况下，这是导致SONFH的累积效应[43]。其次，SONFH还需要分为不同的临床分期进行进一步分析。再次，本研究的病例组与对照组人员都是自合肥及周边地区招募的汉族人口，这可能存在区域选择偏差。最后，本研究纳入的病例组与对照组平均年龄差异较明显，可能存在结果误差。进一步的功能性研究和更大规模的病例对照研究有望避免这些问题，使本研究的结论更具有说服力。