肺腺癌中MFG-E8的表达及其临床意义

姚华宁，延 文，贾 珉，陈 超

肺癌是最常见的恶性肿瘤，5年生存率仅为10%～15%[1-3]。肺腺癌具有高度侵袭性，病死率高，预后差，缺乏有效的预后标志物[4]。因此，探究新的生物学标志物对肺腺癌的治疗及预后意义重大。乳脂球表皮生长因子-8(milk fat globule epidermal growth factor-8, MFG-E8)是一种由巨噬细胞分泌的糖蛋白。MFG-E8已被证实是清除凋亡细胞的重要因子，也是免疫系统中的重要因子[5-7]。近年，有研究表明MFG-E8在多种疾病中发挥特殊作用。目前，MFG-E8在肺腺癌中的作用尚不清楚。本实验采用免疫组化法检测MFG-E8蛋白在肺腺癌及癌旁组织中的表达和定位，分析MFG-E8表达与肺腺癌临床病理特征和预后的关系，为肺腺癌的诊断与治疗提供新线索。

1 材料与方法

1.1 临床资料90例肺腺癌标本来自上海芯超生物科技公司组织标本库。其中88例肺腺癌患者获得随访，时间1～121个月，68例因癌症相关死亡；5年生存率为75.6%。2例失访，随访率为97.8%。

1.2 方法收集肿瘤及癌旁正常肺组织的手术切除标本，与上海国家生物芯片工程中心联合制作组织微阵列(TMA)切片，4 μm厚切片，采用免疫组化EnVision两步法染色。一抗MFG-E8(稀释比1 ∶50)购自Santa Cruz公司。二抗购自Dako公司。以PBS代替一抗作为阴性对照。具体染色步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.3 结果判断由两位高年资病理医师采用双盲法独立评估组织芯片免疫组化染色结果。MFG-E8的判读标准：每张切片均在高倍镜下(400×)随机选取10个视野，读取平均细胞数。(1)按肿瘤阳性细胞百分比进行评分：阳性细胞数≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。(2)按阳性细胞染色强度进行评分：未着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。将上述两项评分结果相乘：0～4分为阴性，5～12分为阳性[8]。

1.4 统计学分析采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计数资料的组间比较采用χ2检验，数据间相关性分析采用Spearman相关分析，生存曲线绘制采用Kaplan-Meier法。

2 结果

2.1 肺腺癌及癌旁组织中MFG-E8的表达MFG-E8表达定位于细胞质及细胞膜(图1)。MFG-E8在癌旁组织和肺腺癌组织中的阳性率分别为14.44%(13/90)、94.44%(85/90)。MFG-E8在肺腺癌中的表达明显高于癌旁正常肺组织(P<0.001)。

图1 MFG-E8的表达：A.MFG-E8在肺腺癌癌旁组织中呈阴性；B.MFG-E8在肺腺癌组织中呈弱阳性；C.MFG-E8在肺腺癌组织中呈强阳性，EnVision两步法

2.2 MFG-E8表达与肺腺癌临床病理特征的关系统计分析显示，MFG-E8表达与患者性别、年龄、有无淋巴结转移、TNM分期无关，与肿瘤大小呈正相关(P<0.05，表1)。

表1 MFG-E8表达与肺腺癌临床病理特征的关系[n(%)]

2.3 MFG-E8表达与肺腺癌患者预后的关系将90例肺腺癌患者癌组织和癌旁组织的MFG-E8表达进行对比分析，结果显示：MFG-E8高表达组肺腺癌患者的生存率明显低于低表达组患者(P<0.001)。MFG-E8表达与肺腺癌患者生存率呈负相关(图2)。

图2 MFG-E8表达与肺腺癌患者预后的关系

3 讨论

MFG-E8又称乳凝集素，通过桥接凋亡细胞和吞噬细胞，促进吞噬细胞对凋亡细胞的吞噬，在介导稳态维持、免疫耐受和增强血管生成中发挥重要作用[9-10]。MFG-E8由2个重复的表皮生长因子样结构域(EGF样结构域)、2个重复的盘素样结构域(C结构域)和1个蛋白样结构域组成。在EGF样结构域，有一个整合素结合基序(integrin-binding motif)，促进αvβ3和αvβ5整合素异二聚体的细胞黏附，并导致整合素介导的信号转导[10]。研究表明，该蛋白具有多种功能。在肿瘤微环境中MFG-E8通过协调αvβ3信号通路，促进黑色素瘤进展[11]。MFG-E8在结直肠癌[12]、口腔鳞状细胞癌[13]、肝细胞癌[14]、乳腺癌[15-16]中的表达明显上调。MFG-E8基因缺失可预防小鼠缺氧引起的肺动脉高压[17]，但是MFG-E8在肺腺癌中的作用和机制尚不清楚。

此前有研究报道，MFG-E8促进口腔鳞状细胞癌的肿瘤进展[13]。Jia等[12]也证实MFG-E8在人类结直肠癌中表达的高水平调控。本实验发现，在肺腺癌组织中MFG-E8蛋白表达水平明显高于癌旁正常肺组织，提示MFG-E8高表达可能促进正常肺泡上皮细胞向肺腺癌的恶性转化，在此过程中发挥癌基因作用。其机制可能为癌症干细胞能特异性刺激肿瘤相关巨噬细胞表达MFG-E8，MFG-E8通过STAT3和Hedgehog信号通路诱导癌症干细胞向肿瘤转化以及对抗肿瘤药物的抵抗。本实验亦发现MFG-E8高表达与肿瘤大小明显相关(P<0.05)，与患者性别、年龄、有无淋巴结转移及TNM分期无关，提示MFG-E8促使肿瘤进展。MFG-E8是血管内皮生长因子诱导的血管生成的关键，其表达上调也可以促进肿瘤血管的生长[9-10]，从而促成肿瘤进展。有报道称MFG-E8蛋白高表达是黑色素瘤[11]的独立不良预后因素。然而，MFG-E8在肺腺癌中的表达及与患者预后的关系至今尚未见文献报道。本实验结果显示，肺腺癌组织中MFG-E8的表达明显高于癌旁组织，MFG-E8高表达组肺腺癌患者的生存率明显低于低表达组患者(P<0.001)，提示MFG-E8可能是肺腺癌的不良预后潜在标志物。

本实验发现MFG-E8在肺腺癌组织中高表达，其表达与肿瘤大小和不良预后相关，提示MFG-E8可能促进肺腺癌的发生，是一种新的肺腺癌预后标志物。